Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free
Summary
Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l’esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un’apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.
Abstract
Analisi multiplex della proteina ha mostrato sensibilità diagnostica superiore e precisione rispetto alle singole proteine. Microarrays dell’anticorpo consentono migliaia di test immunodiagnostici di micro-scala eseguite contemporaneamente su un singolo chip. Formato di dosaggio sandwich migliora la specificità dell’analisi rilevando ogni destinazione con due anticorpi, ma soffre di reattività crociata fra i reagenti, limitando così la loro capacità di multiplexing. Microarray di colocalizzazione dell’anticorpo (ACM) è stato sviluppato per la rilevazione di proteine “multiplex” cross-reactivity-gratis, ma richiede un costoso spotter in loco per la produzione di microarray durante le analisi. In questo lavoro, dimostriamo una tecnologia di chip di snap che trasferisce il reagente da microarray a DNA-microarray di schiocco semplicemente due chip insieme, che così nessun spotter è necessaria durante l’incubazione del campione e la successiva applicazione degli anticorpi di rilevamento (danti) su deposito di diapositive pre-macchiati, dissociando la preparazione del vetrino dall’esecuzione di test. Entrambi i metodi di trasferimento di singole e doppie sono presentati per ottenere l’allineamento tra i due microarray e la fabbricazione di diapositiva per entrambi i metodi sono descritti. I risultati indicano che < 40 μm allineamento è stato realizzato con doppio trasferimento, raggiungendo una densità di matrice di 625 punti/cm2. Un immunoassay 50-plexed è stato condotto per dimostrare l’utilizzabilità del chip lo snap in analisi multiplex della proteina. Limiti di rilevazione delle 35 proteine sono nella gamma di pg/mL.
Introduction
Un pannello di biomarcatori che comprende proteine multiple può fornire maggiore sensibilità e specificità rispetto al singolo biomarcatore nella diagnosi di malattie complesse come cancri1,2. L’analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) è stata la tecnologia di gold standard utilizzata nei laboratori clinici, raggiungimento di un limite di rilevazione a basso pg/mL nel plasma, ma limiti a una sola destinazione per dosaggio3,4,5. Microarrays dell’anticorpo sono stati sviluppati per accogliere migliaia di saggi miniaturizzati condotto in parallelo su un microscopio singola diapositiva6,7,8. Tuttavia, la capacità di multiplexing di questo metodo è limitata dalla reattività crociata reagente-driven, derivanti dall’applicazione di una miscela di dAbs, e diventa più problematico con un numero crescente di target9,10 , 11. Pla et al. hanno dichiarato che la vulnerabilità risultante di un’analisi multiplex panino bilance come 4N(N-1) dove N è il numero dei bersagli12.
Per attenuare la reattività crociata in microarrays dell’anticorpo, anticorpo colocalizzazione microarray (ACM) è stato sviluppato nel nostro laboratorio per sandwich multiplex assay12. Gli anticorpi di cattura (cabine) sono macchiati su un substrato con uno spotter di microarray. Dopo blocchi campioni vengono applicati sulla superficie, e quindi i singoli tocchi sono macchiati sulle stesse macchie con il complesso antigene-cabina. Tutti gli scenari di reattività crociata tra antigeni e anticorpi possono essere mitigati con ACM e limiti di rilevazione a pg/mL sono stati raggiunti. Tuttavia, il protocollo del test richiede preparazione e spotting i danti durante gli esperimenti usando un microarray in loco spotter con alta precisione per scopo di allineamento, che è costoso e richiede tempo, limitare l’ampia applicazione di questa tecnologia in altri laboratori. Un palmare ACM, denominato snap chip è stato sviluppato per cross-reactivity-gratis e privo di spotter multiplex panino immunoassays13,14,15. i taxi e i tocchi sono pre-macchiati su una diapositiva di dosaggio e un trasferimento rispettivamente nel formato microarray e memorizzati. Durante il dosaggio, le diapositive vengono recuperate e un microarray di tocchi sono trasferite collettivamente il vetrino di saggio semplicemente schioccando i due chip insieme. Un’apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento affidabile reagente. Diapositive di nitrocellulosa rivestita con una capacità di legame dell’anticorpo relativamente grandi sono stati usati come gli scivoli di dosaggio per assorbire le goccioline di liquide e facilitando così il trasferimento di reagente, tuttavia, le diapositive sono più costose di microarray e diapositive di vetro regolare scanner compatibile con diapositive non trasparenti sono necessari per l’acquisizione del segnale.
In questo lavoro, dimostriamo il protocollo di esecuzione di un immunodosaggio a sandwich multiplex con un chip di snap. Un apparato di romanzo snap è stato sviluppato per il trasferimento di reagente più conveniente e affidabile da microarray a DNA-microarray. Cosa importante, qui abbiamo stabilito il metodo di trasferimento di reagente su vetrini regolari con il chip di snap. 1024 punti correttamente trasferiti e allineati su una lastra di vetro, espandendo significativamente l’uso di questa tecnologia nella maggior parte dei laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, abbiamo presentato una tecnologia di chip di snap che rende i test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex ampiamente disponibili per i ricercatori con base messa a punto sperimentale. Diverso da microarrays dell’anticorpo esistente, nessun spotter microarray è necessaria per gli utenti finali. Sono dimostrati sia singola che doppia i metodi di trasferimento, e raddoppiare il transfer offre una precisione di allineamento superiore verso il basso per ~ 40 μm per macchie di 98%, con il più grand…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Rob Sladek per l’uso del cercatore a getto d’inchiostro. Riconosciamo il supporto finale da istituti canadesi per Health Research (CIHR), scienza naturale e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC), l’Istituto di ricerca di società cancri canadese e la Fondazione canadese per l’innovazione (CFI). D.J. grazie sostegno da un Canada Research Chair.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
Referencias
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
