Rigenerazione di microelettrodi oro allinearono attrezzata per un analizzatore in tempo reale delle cellule

Summary

Questo protocollo descrive una strategia generale per rigenerare microelettrodi oro allinearono commerciali attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta finalizzato al risparmio sull’alta analisi di ofmicrochip-based di costi in esecuzione. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura, che consente l’utilizzo ripetuto di microchip.

Abstract

Il dosaggio di basati su cellule privo di etichetta è vantaggioso per lo studio biochimico a causa di esso non richiede l’uso di animali da esperimento. Grazie alla sua capacità di fornire informazioni più dinamici sulle celle in condizioni fisiologiche più classiche analisi biochimiche, questo saggio di cellulare privo di etichetta in tempo reale sulla base del principio di impedenza elettrica sta attirando l’attenzione di più nel corso degli ultimi decennio. Tuttavia, la sua utilizzazione pratica può essere limitata a causa del costo relativamente costoso di misura, in cui vengono utilizzati microchip oro monouso consumabile costosa per l’analizzatore di cella. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una strategia generale per rigenerare allinearono microelettrodi oro attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta commerciale. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura. Il metodo proposto è stato testato e dimostrato di essere efficace per la rigenerazione e l’uso ripetuto di piastre elettroniche commerciali almeno tre volte, che aiuterà i ricercatori Risparmia sull’alto costo in esecuzione di analisi in tempo reale delle cellule.

Introduction

Grazie alla sua efficiente e meno laborioso processo sperimentale, tecnologia privo di etichetta cell-based ha assistito a rapida crescita nell’ultimo decennio per scopi analitici, nonché lo screening come sotto l’aspetto della proteomica^1,2 , droga consegna³, ecc.^4,5 confronto con metodi biochimici tradizionali finalizzato all’analisi di cellule, analisi delle cellule privo di etichetta in tempo reale con il prototipo sviluppato da Giaever e colleghe precedentemente⁶ si basa sul principio della registrazione delle modifiche di segnale elettrico sulla superficie della cella associata microchip, che consentono una misurazione continua della crescita delle cellule o la migrazione in maniera quantitativa. Seguendo questa strategia, è stato lanciato un cellulare in tempo reale (RT-CES) sistema utilizzando il principio di rilevamento basati su impedenza elettrica è stato introdotto^7,8 e, più recentemente, un analizzatore di commerciale in tempo reale delle cellule (RTCA) di rilevamento elettronico per laboratorio ricerca⁹.

L’analizzatore di cellulare in tempo reale delle imprese principalmente legge segnali evocati delle cellule di impedenza elettrica, che derivano da cambiamenti fisiologici delle cellule incubate tra cui proliferazione, migrazione, vitalità, morfologia e aderenza sul superficie di microchip^10,11. Tali segnali elettrici sono ulteriormente convertiti dall’analizzatore in un parametro adimensionale chiamato l’indice di cella (IC) per valutare lo stato delle cellule. La variazione dell’impedenza di microchip riflette principalmente l’ambiente ionico locale delle cellule coperte all’interfaccia elettrodo/soluzione. Di conseguenza, le prestazioni analitiche dell’analizzatore delle cellule si basa principalmente sull’unità di rilevamento di nucleo, i microchip usa e getta (cioè, cosiddetti piastre elettroniche, ad esempio, 96/16/8 pozzetti), che sono fatti di microelettrodi oro disposti litograficamente stampato in fondo dei pozzetti di incubazione. L’oro microelettrodi assemblare in un cerchio-su-linea formato (Figura 1) e coprono la maggior parte della superficie dei pozzetti di incubazione, che consentire il rilevamento dinamico e sensibile di cellule allegate^{3,12,13 ,14}. CI sarà nel caso di copertura più superficiale delle cellule sul chip, quando aumentano e diminuiscono le cellule sono esposte a un tossico conseguente apoptosi. Anche se l’analizzatore in tempo reale delle cellule è stato spesso utilizzato per determinare la citotossicit๹ e neurotossicità¹⁵ e fornire più informazioni cinetiche di metodo classico endpoint, le piastre elettroniche usa e gettare sono il più costoso materiale di consumo.

Fino ad ora, non ci sono stati nessun metodi disponibili per la rigenerazione della piastra elettronica, che è probabilmente dovuto al fatto che condizioni di rigenerazione dura, come soluzione piranha o acido acetico sono coinvolti^{16,17, 18}, che possono alterare lo stato elettrico di microchip oro. Di conseguenza, un metodo delicato ed efficace per rimuovere le celle aderenti e altre sostanze dalla superficie di gettoni d’oro sarà desiderabile per il processo di rigenerazione di piastra elettronica. Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo volto alla rigenerazione delle piastre elettroniche monouso utilizzando reagenti non corrosivo e i chip rigenerati sono stati caratterizzati da metodi elettrochimici come pure ottico¹⁹. Utilizzando i reagenti di laboratorio prontamente disponibili e moderata tra cui tripsina ed etanolo, abbiamo stabilito un metodo generale per rigenerare la piastra elettronica commerciale senza effetti negativi, che è applicata con successo per rigenerare i due tipi principali della piastra elettronica (16 e L8) utilizzato per RTCA.

Protocol

Nota: In generale, il processo di rigenerazione include digestione della tripsina e passaggio di risciacquo con acqua ed etanolo. Il tempo di digestione cambia in base al numero di celle utilizzate, e il tipo e il numero di celle utilizzate possono differire a seconda gli scopi sperimentali. Si consiglia di controllare i microchip rigenerati utilizzando metodi ottici ed elettrochimici per ottimizzare le condizioni di rigenerazione. Durante l’esperimento, sostanze chimiche solubili e insolubili possono essere coinvolti, e…

Representative Results

Proprietà della superficie di oro microchip: le procedure di rigenerazione utilizzate nel presente protocollo sono state delineate nella Figura 1. La figura 2 Mostra il microscopico immagini di fresco in superficie e rigenerata piastre elettroniche dal microscopio ottico. Come mostrato in Figura 2A e Figura 2, al microscopio le osserv…

Discussion

Abbiamo riassunto diversi metodi disponibili^{17,23,24,25,26} per la rigenerazione di microchip nella tabella 1. Fondamentalmente, questi metodi coinvolti relativamente dure condizioni sperimentali per ottenere la completa rigenerazione dei chip a causa della presenza di interazioni molecola-molecola forte come quello del complesso immune per SPR…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.