استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

Summary

التحليلات الكيميائية الحيوية والهيكلية للبروتينات الغليكوزيلاتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من عينات متجانسة. وهنا نقدم طريقة كيميائية فعالة جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف تنقيته من البكتيريا باستهداف رد الفعل Cys ثيولس.

Abstract

تفاعل stromal جزيء-1 (STIM1) نوع–أنا transmembrane البروتين الموجود على هيولى (ER) وأغشية البلازما (بعد الظهر). STIM1 ER-المقيم ينظم نشاط قنوات Orai1 م في عملية تعرف باسم مخزن الإدخال تعمل الكالسيوم (Ca^{2 +}) الذي هو الرئيسي Ca^{2 +} مما يشير إلى العملية التي تقود الاستجابة المناعية. يخضع STIM1 نبوستترانسلاشونال-جليكوسيليشن في موقعين Asn لومينال ضمن Ca^{2 +} الاستشعار عن المجال للجزيء. ومع ذلك، الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية، والآثار البيولوجية هيكل من N-الغليكوزيلاتي STIM1 كانت غير مفهومة حتى مؤخرا بسبب عدم القدرة على سهولة الحصول على مستويات عالية من البروتين-الغليكوزيلاتي نمتجانسة. وهنا يصف لنا التنفيذ في المختبر الكيميائي النهج الذي تولي مويتيس الجلوكوز لمواقع البروتين محددة تنطبق على فهم آثار N-جليكوسيليشن الكامنة في بنية البروتين وآلية. استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الحل نقوم بتقييم كفاءة كلا من التعديل، فضلا عن عواقب الهيكلي المرفق الجلوكوز مع عينة واحدة. هذا النهج يمكن تكييفها مع سهولة لدراسة البروتينات الغليكوزيلاتي العديدة الموجودة في الطبيعة.

Introduction

تخزين الكالسيوم تعمل (Ca^{2 +}) إدخال (سوسي) هو الطريق الرئيسية التي تأخذ الخلايا المناعية يصل Ca^{2 +} من الفضاء خارج الخلية إلى سيتوسول. في الخلايا اللمفية تي، ربط مستقبلات خلية تي يقع في غشاء البلازما (م) مولدات المضادات التي تنشيط بروتين تيروزين مؤنزم (استعرض في ^1،،من²³). سلسلة الفسفرة يؤدي إلى تنشيط phospholipase-γ (PLCγ) الذي يتوسط التحلل المائي لغشاء فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة₂) فيما بعد إلى دياسيلجليسيرول واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP₃ ). الملكية الفكرية₃ هو رسول ديفوسيبلي صغيرة التي تلزم للملكية الفكرية₃ مستقبلات (IP₃R) في هيولى (ER) مما فتح هذه القناة مستقبلات وسمحت Ca^{2 +} تدفق أسفل التدرج تركيز لائحة التجويف إلى سيتوسول (استعرض في ⁴). مستقبلات الإشارات من البروتين ز إلى جانب وتيروزين كيناز مستقبلات في مجموعة متنوعة من الرصاص أنواع منفعل وغير منفعل خلية أخرى لإنتاج نفس IP₃ والتنشيط للملكية الفكرية₃روبية.

سبب المحدودة Ca^{2 +} السعة التخزينية للائحة، الملكية الفكرية₃-الإفراج عن الوساطة والزيادة الناتجة في كاليفورنيا سيتوسوليك^{2 +} فقط عابر؛ ومع ذلك، آثار هذا استنفاد ER لومينال Ca^{2 +} عميقا نوع التفاعل stromal جزيء-1 (STIM1)،–أنا ترانسميمبراني (TM) العثور على البروتين معظمها على غشاء ER ^5،،من⁶⁷. STIM1 يحتوي على المنحى التجويف Ca^{2 +} الاستشعار عن مجال تتكون من زوج EF-اليد والعقيمة α-عزر (أفسام). يتم فصل ثلاثة مجالات لفائف ملفوف المنحى سيتوسوليك من أفسام بالمجال TM واحد (في ⁸استعراض). عند ER Ca^{2 +} نضوب لومينال، يخضع أفسام^{9 7،}أوليجوميريزاتيون إلى جانب زعزعة الاستقرار التي تسبب ترتيبات هيكلية جديدة من الخرائط المواضيعية والمجالات لفائف ملفوف ¹⁰. تتوج هذه التغييرات الهيكلية في تعويض STIM1 في ER-م تقاطعات ^11،12،،من¹³¹⁴ من خلال التفاعلات مع فوسفوينوسيتيديس الساعة ^{15، 16} و Orai1 مفارز ^17،18. Orai1 البروتينات هي مفارز م فيها تجميع للنموذج Ca^{2 +} قنوات ^19،20،،من²¹²². تسهيل التفاعلات STIM1-Orai1 في تقاطعات ER-م فتح Ca^{2 +} الإفراج عن تنشيط Ca^{2 +} (قلعة) قناة المطابقة التي تمكن الحركة من Ca^{2 +} في سيتوسول من تركيزات عالية الفضاء خارج الخلية. في الخلايا المناعية، حمل سيتوسوليك المطرد Ca^{2 +} المرتفعات عبر قنوات قلعة Ca^{2 +}-كالمودولين/calcineurin تعتمد ديفوسفوريليشن للعامل النووي من خلايا تي المنشط الذي يدخل بعد ذلك النواة و يبدأ تنظيم النسخي الجينات تعزيز تي خلية التنشيط ^1،3. ما يسمى عملية التنشيط قناة قلعة STIM1 ^23،24 عن طريق فعل مؤثر ER لومينال Ca^{2 +} نضوب والناتجة عن المطرد سيتوسوليك Ca^{2 +} الارتفاع جماعي سوسي ²⁵. يتضح الدور الحيوي الذي تؤديه سوسي في خلايا تي بدراسات تثبت أن الطفرات الموروثة في كل من STIM1 و Orai1 يمكن أن تسبب نقص المناعة المشتركة الشديد المتلازمات ^3،،من^{1926، 27}-يبدأ أفسام سوسي بعد الاستشعار ER لومينال Ca^{2 +} استنفاد عبر فقدان Ca^{2 +} التنسيق على يد EF الكنسي، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رابطة الذاتي إلى جانب زعزعة الاستقرار ^{7، 28،29}.

جليكوسيلاتيون هو مرفق التساهمية وتجهيز الهياكل oligosaccharide، ويعرف أيضا باسم جليكانس، من خلال مختلف الخطوات السكروز في ER وغولجي (استعرض في ^30،،من³²³³). هناك نوعين الغالب من جليكوسيلاتيون في حقيقيات النوى: N-مرتبط و يا-مرتبطة، اعتماداً على الأحماض الأمينية المحددة وذرة سد الربط. ترفق أميد سلسلة جانبية من Asn في N-جليكوسيليشن، جليكانس، وفي معظم الحالات، يحدث خطوة البدء لائحة ببتيد سلسلة التحركات في التجويف ³⁴. وتتمثل الخطوة الأولى من N-جليكوسيليشن نقل بنية أساسية أربعة عشر-السكر تتكون من الجلوكوز (الأخضر)، ويطلق (رجل) و نون-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك) (أي الأخضر₃رجل₉جلكناك₂) من ER غشاء الدهن ^35،أوليجوساكتشاريلترانسفيراسي³⁶. مزيد من الخطوات، مثل الانقسام أو نقل مخلفات السكر، التي تحفزها لائحة محددة جليكوسيداسيس وجليكوسيلترانسفيراسيس. يمكن أن تكون بعض البروتينات التي تترك لائحة وأن تنتقل غولجي كذلك المجهزة ³⁷. س-جليكوسيلاتيون يشير إلى إضافة جليكانس، عادة إلى مجموعة الهيدروكسيل سلسلة الجانب بقايا سر أو منتدى المجالس الرومانسية، ويحدث هذا التعديل تماما في ^33،مجمع غولجي³⁴. وهناك العديد من الهياكل-جليكان سالتي يمكن أن تتكون من N-أسيتيلجلوكوساميني، فوكوسي، واللبن، وإضافة حمض اللعابي مع كل أحادي التسلسل ³³.

في حين تم التعرف على لا تسلسل معين كشرط أساسي لأنواع عديدة من س-جليكوسيلاتيون، ارتبط تسلسل آراء مشتركة N-يرتبط التعديل: Asn-X-Ser/الثريونين/Cys، حيث X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية ما عدا المحترفين ³³. أفسام STIM1 يحتوي على اثنين من هذه المواقع-glycosylation توافق N: Asn131-Trp132-Thr133 و Asn171-Thr172-Thr173. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن أفسام ن-الغليكوزيلاتي في خلايا الثدييات في Asn131 و Asn171 ^38،39،،من⁴⁰⁴¹. بيد أن الدراسات السابقة المترتبة على N-جليكوسيليشن على سوسي كانت تتعارض، مما يوحي بقمعها، بوتينتياتيد أو أي تأثير من هذا التعديل بوستترانسلاشونال في^، سوسي التنشيط ³⁸= “xref” >^40،،39⁴¹. وهكذا، البحوث المتعلقة بآثار أفسام N-جليكوسيليشن الفيزيائية-الحيوية والكيمياء الحيوية والهيكلية الكامنة وراء أمر حيوي لفهم الآثار التنظيمية لهذا التعديل. بسبب الحاجة إلى مستويات عالية من البروتينات متجانسة في هذه التجارب في المختبر ، تم تطبيق نهج موقع انتقائي لإرفاق الجلوكوز مويتيس أفسام تساهمي. من المثير للاهتمام، جليكوسيليشن Asn131 و Asn171 بسبب التغييرات الهيكلية التي تتقارب داخل نواة أفسام وتحسين الخصائص الفيزيائية-الحيوية التي تنهض بوساطة STIM1 سوسي ⁴².

ملحق الكيميائية من جماعات glycosyl ثيولس Cys كانت راسخة بعمل المنوي التي أثبتت فائدة هذا النهج خال من إنزيم لفهم آثار خاصة بالموقع جليكوسيلاتيون على وظيفة البروتين ⁴³ أولاً ^{, 44}-في الآونة الأخيرة، وفيما يتعلق STIM1، كانت تحور بقايا Asn131 و Asn171 إلى Cys و glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] وكان يستخدم لربط تساهمي الجلوكوز ثيولس الحرة ⁴². وهنا، يمكننا وصف هذا النهج الذي لا يستخدم الطفرات لإدراج موقع بقايا Cys محددة لتعديل فحسب، بل ينطبق أيضا على حل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) لسرعة تقييم كفاءة التعديل والهيكلية الاضطرابات نتيجة جليكوسيليشن. جدير بالذكر أن هذه المنهجية العامة يمكن تكييفها بسهولة دراسة آثار أما O-أو N-جليكوسيليشن أي ريكومبينانتلي إنتاج البروتين.

Protocol

1-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)-وساطة الطفرات موقع الموجه لإدماج Cys في ناقل تعبير بكتيرية الحيوانات الأليفة-28 ألف- تحديد تركيز ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف (أي دنا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معامل انقراض سم (ميكروغرام/مل) 0.020 <s…

Representative Results

الخطوة الأولى من هذا النهج يتطلب الطفرات مخلفات glycosylation المرشح لبقايا Cys التي يمكن أن تكون قابلة للتعديل باستخدام أفسام الجلوكوز-5-mts. قد لا توجد بقايا Cys الذاتية، حيث لا توجد اعتبارات خاصة بحاجة إلى بذل قبل الطفرات. بيد يجب أن تحور أصلي Cys بقايا لبقايا غير قابلة للتعديل قبل …

Discussion

جليكوسيليشن البروتين تعديل بوستترانسلاشونال حيث تساهمي المرفقة السكريات البروتينية أساسا عن طريق الروابط إلى سلاسل الحمض الأميني الجانبية. ما يصل إلى 50% بروتينات الثدييات هي الغليكوزيلاتي ⁵⁴، حيث أن البروتينات الغليكوزيلاتي فيما بعد يمكن أن يكون مجموعة متنوعة من التأثيرات …

Materials

Phusion DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530S	Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme	New England Biolabs, Inc.	R0176	Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit	GeneAid, Inc.	PDH300	Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Use in step 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin	Thermo Fisher Scientific	88221	Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing	BioDesign, Inc.	D306	Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators	Sartorius, Inc.	VS2001	Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26630	Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System	GE Healthcare, Inc.	29018224	Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer	Agilent Technologies, Inc.		Use in step 5.2 and 5.5.