Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama
Summary
Este protocolo describe el desarrollo de un en vitro preclínicos modelo humano de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica con líneas de celulares de cáncer de mama para imitar la interacción de osteoclastos células de cáncer. El modelo podría utilizarse para mejorar nuestra comprensión de la formación de metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.
Abstract
La interferencia entre células tumorales y las células óseas en el microambiente óseo es fundamental para comprender el mecanismo de formación de metástasis ósea. Hemos desarrollado un en vitro totalmente humano modelo preclínico de cocultivo de células de cáncer de mama y monocitos en la diferenciación a osteoclastos. Hemos optimizado un modelo de osteoclastogénesis a partir de una muestra de sangre periférica de donantes sanos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) primero fueron separadas por centrifugación de gradiente de densidad, sembradas a una densidad alta e inducidas a distinguir mediante la adición de dos factores de crecimiento (GFs): receptor activador del factor nuclear-κB ligando (RANKL) y macrófagos factor estimulante de colonias (MCSF). Las células se dejan en cultivo durante 14 días fijos y analizadas por análisis aguas abajo. En las metástasis óseas osteolíticas, uno de los efectos de la llegada de células de cáncer de hueso es la inducción de la osteoclastogénesis. Así nos desafió a nuestro modelo con co-cultivos de células de cáncer de mama para estudiar el poder de diferenciación de las células del cáncer con respecto a los GFs. Una forma sencilla de estudiar la interacción de la célula osteoclasto de cáncer debe realizar co-cultivos indirectas basadas en el uso de medio condicionado obtenidos de cultivos de células de cáncer de mama y se mezcla con medio fresco. Esta mezcla se utiliza para inducir la diferenciación de los osteoclastos. También hemos optimizado un método de cultura cooperación directa en que el cáncer de células en diferenciación de monocitos compartan el medio y secretadas factores de intercambio. Se trata de una mejora significativa sobre el método original de cultura cooperación indirecta como los investigadores pueden observar las interacciones recíprocas de los dos tipos celulares y realizar análisis posteriores de las células cancerosas y osteoclastos. Este método nos permite estudiar el efecto de las drogas en el microambiente óseo metastásico y a líneas celulares de semillas que no sean las derivadas de cáncer de mama. El modelo también puede utilizarse para estudiar otras enfermedades como la osteoporosis u otras condiciones de hueso.
Introduction
El hueso es un sitio común de metástasis para los diferentes tipos de tumores primarios como el cáncer de próstata, de pulmón y de mama, con 20-25% de pacientes que desarrollan metástasis óseas en el curso de la enfermedad1,2,3. En particular, el 70% de pacientes con cáncer de mama llevar evidencia de la metástasis del hueso en muerte4. Tumor y células estromales interacción es esencial para la progresión del cáncer en cáncer primario y lesiones secundarias. En el microambiente óseo, metástasis óseas osteolíticas del cáncer de mama dependen de la creación de un círculo vicioso patológico que se produce entre las células cancerosas, las células óseas y el microambiente óseo. Las células cancerosas alteran equilibrio óseo, aumento de resorción de hueso5,6,7.
En condiciones normales y patológicas, los osteoclastos son las células responsables de resorción del hueso, mientras que los osteoblastos, en depósito de nueva matriz, son responsables de la formación de hueso nuevo8. Actividad de los osteoclastos está regulada por los osteoblastos a través de la expresión de RANKL, que se une a su receptor RANK en la superficie de los osteoclasta, inducir la fusión de los osteoclasta, un proceso necesario para la diferenciación a osteoclastos maduros. La inducción de la osteoclastogénesis aumenta la resorción del hueso. Un gran número de estudios en vivo ha mejorado significativamente nuestra comprensión del hueso metástasis formación9,10,11. Las células de cáncer de mama desde el tumor primario y en el microambiente óseo perturban la homeostasis del hueso, promoción de la osteoclastogénesis y8de la resorción del hueso. En este escenario, todas las interacciones moleculares que se producen entre las células cancerosas y osteoclastos son de crucial importancia. Como ya se mencionó, el mecanismo de formación de metástasis de hueso ha sido dilucidado en modelos de ratones en vivo . Sin embargo, además de la necesidad de la aprobación de todos en vivo los experimentos con animales por el Comité de ética, hay varios otros inconvenientes para realizar en vivo experimentos incluyendo métodos desperdiciadores de tiempo y altos costos. Varios autores han combinado modelos en vivo y en vitro preclínicos de osteoclastogénesis usando una línea murina de osteoclastos antes llamado RAW246.79,10,11. Los inconvenientes de este modelo provienen del hecho de que las células ya se han comprometido a convertirse en los osteoclastos y no son de origen humano. Por estas razones, investigación traslacional podría beneficiarse grandemente de la disponibilidad de en vitro modelos preclínicos plenamente humana para estudiar interacciones de celular de cáncer de hueso.
Hemos optimizado un método de osteoclastogénesis en vitro a partir de muestras de sangre periférica12,13. Los osteoclastos derivan de monocitos, que están presentes, aunque en un grado pequeño, en muestras de sangre periférica. Las células mononucleares se separan primero de los eritrocitos y granulocitos en sangre por gradiente de densidad Ficoll; luego se seleccionan gracias a su capacidad para adherirse al sustrato de plástico, a diferencia de los linfocitos. Después de la siembra, las células se cultivan durante 14 días. MCSF y RANKL son GFs requeridos por monocitos diferenciar primero en macrófagos y luego en osteoclastos14,15. MCSF es necesario para toda la duración del ensayo, mientras que el RANKL se utiliza para inducir el proceso de diferenciación en las etapas finales de la osteoclastogénesis. En la fase temprana de la diferenciación, MCSF ayuda a monocitos proliferar y sobrevivir14,15. Durante la segunda parte de la osteoclastogénesis, las células se fusionan y maduran como osteoclastos, que muestra la distribución característica de F actina en anillos y expresan marcadores específicos tales como la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) y del receptor de calcitonina (CTR) 14 , 15. nuestro método consiste en Añadir MCSF a la cultura de monocitos para los primeros 7 días de la experiencia y una combinación de MCSF y RANKL de días 7 a 14. Al final del experimento, se analizan la osteoclastogénesis contando las células diferenciadas, como se detalla a continuación.
Los cultivos de monocitos inducidos a distinguir por GFs forman la base de nuestro modelo preclínico. Hemos optimizado un sistema de cocultivo sin GFs para entender mejor el poder de la osteoclastogenic de las células de cáncer de mama. Primero desarrollamos un modelo de co-cultivos indirectas mediante la adición de un medio (80% α-medio esencial mínimo (MEM-α) y 20% acondicionado medio recogieron de un cultivo de células de cáncer de mama que sobre 90% confluente de células experimentaban diferenciación12 . El medio condicionado (no recogido en las condiciones de privación de suero) se recogió después de 24 horas y mezclados con medio fresco en una proporción de 1:4. El medio condicionado había inducido diferenciación osteoclasta significativo con respecto al control negativo. Sin embargo, como la información sobre la interacción recíproca entre células cancerosas y las células óseas se pierde cuando usando co-cultivos indirectas, hemos mejorado nuestro sistema mediante la realización directas co-cultivos. Siembran las células cancerosas en 0.4 μm inserta y los colocaba en los pozos donde las células mononucleares fueron plateadas. Usando este método, las células comparten el mismo medio e intercambian de proteínas secretadas. Así creamos un modelo preclínico plenamente humano de osteoclastogénesis inducida por las células de cáncer13.
Este sistema es extremadamente versátil y puede ser utilizado para fines de investigación, por ejemplo, en estudios farmacológicos investigar el papel de los fármacos en la metástasis del hueso. Nuestro modelo permite estudiar la eficacia y mecanismos de acción de tratamientos dirigidos a hueso o fármacos antitumorales en el microambiente óseo en presencia de células de cáncer13. Diseño de los experimentos con los correctos controles, es decir, las células cancerosas y osteoclastos cultivados individualmente, resulta más fácil comprender el impacto de la cultura de cooperación en la actividad de la droga. Este enfoque se vuelve aún más interesante cuando la droga en estudio apunta ambos cáncer células y osteoclastos, por ejemplo, everolimus16. Este modelo puede utilizarse también para identificar nuevas vías de interacción entre las células cancerosas y las células óseas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preclínicos en vitro modelos de estudio de los mecanismos de interferencia entre las células cancerosas y las células óseas son necesarios para identificar los mecanismos de la metástasis del hueso que pueden usarse para crear nuevas estrategias terapéuticas. Hemos desarrollado un modelo plenamente humanos en vitro de osteoclastogénesis de sangre periférica (figura 3). Durante la optimización de la metodología, un número de puntos críticos fueron identificado y …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Yibin Kang para proporcionar la línea de celular SCP2 y Cristiano Verna para asistencia editorial.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
Referencias
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