CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견
Summary
여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.
Abstract
(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl– 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.
Introduction
Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막1내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis2의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.
세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강3악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상4. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC5에 대 한 치료를 개선할 수 있습니다. 수많은 생물 학적 프로세스를 포함 하는 이온 채널 다른 암6의 개발에 중요 한 역할을 표시 합니다. Cl– 채널의 부분 또는 전체 참여 매우 활성 마이그레이션, 확산 및 침해의 높은 비율을 포함 하 여 종양 약의 다양 한 속성에 포함 된다. 이 비추어 클릭, 비 발한 단백질 가족, 암 치료6,7에 대 한 치료 목표의 유망한 클래스 나열 되었습니다. 최근 연구는 계시 했다 CLIC1, CLIC4, CLIC5, 등 클릭 가족의 심장 미토 콘 드리 아를 지역화 반응성 산소 종 (선생님) 레벨 이며 CLIC5에 의해 upregulated Cl 있는 미토 콘 드리 아의 기능 역할을 나타내는 – apoptotic 응답8채널. CLIC4, (일컬어 mtCLIC, P64H1, 및 RS43), 클릭 가족의 한 구성원을 가장 광범위 하 게 암 세포 및 subcellular 위치 등 골, 바인딩과 그물 mitochondrion 인간의 apoptotic 규칙 속성에 대 한 공부 하고있다 keratinocytes7,,910. CLIC4의 식 프로필 종양 괴 사 인자-α (TNF-α), P53, 그리고 외부 자극에 의해 규제 했다. Overexpression 및 CLIC4의 downregulation Bcl-2 가족 구성원의 불균형 caspase 캐스케이드의 활성화 및 시 토 크롬 C11, 의 출시와 함께 미토 콘 드리 아 통로 통해 주로 apoptotic 응답 방 아 쇠 12 , 13. 따라서, MMP 측정 하는 중요 한 탐구 CLIC4 관련 apoptosis 그리고 Rh123 이상적인 형광 표시기로 제공.
현재 연구 HN4 셀에 CLIC4 최저 유도 된 apoptosis를 공부 하는 MMP의 검출에 대 한 자세한 프로토콜을 설명 합니다. Rh123 형광 프로브로는 MMP의 변화를 관찰 하는 데 사용 됩니다. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변동 해결 될 수 있습니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 자세히, 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여. 이 프로토콜도 다른 apoptosis 관련 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
잘 Cl− 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암17에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
친절 하 게 우리는 세포 배양에 대 한 씨 차오 팡 감사합니다. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81570403, 81371284);의 자연 과학 재단에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 안후이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 1408085MH158); 안후이 의과대학;의 뛰어난 젊은 수 사관 안후이 성의 대학에 우수한 젊은 인재에 대 한 프로그램을 지원합니다.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
Referencias
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
