Оценка вторжения клеток и процесс миграции: сравнение видео на базе микроскопа нуля раны пробирного и пробирной палаты Бойдена
Summary
Это исследование доклады двух различных методов для анализа клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и в пробирке видео на базе микроскопа заживление assay. Описываются протоколы для этих двух экспериментов, и сравнение их преимущества и недостатки.
Abstract
Вторжения и миграции способности опухолевых клеток являются главными источниками прогрессии рака и повторения. Многие исследования изучили миграции и вторжения способности, чтобы понять, как распространение раковых клеток, с целью разработки новых стратегий лечения. Анализ клеточных и молекулярные основы этих способностей привело к характеристика клеток мобильности и физико-химических свойств цитоскелета и клеточных микроокружения. На протяжении многих лет Пробирной палаты Бойден и пробирного скретч раны были стандартные методы для изучения клеток вторжения и миграции. Однако эти два метода имеют ограничения. Пробирная палата Бойден, сложным и трудоемким, и пробирного скретч раны имеет низкая воспроизводимость. Развитие современных технологий, особенно в микроскопии, увеличилась воспроизводимость assay скретч рану. С помощью мощных аналитических систем, видео Микроскоп «инкубатор» может использоваться для обеспечения автоматического и в реальном времени анализ миграции клеток и вторжения. Целью этого документа является отчет и сравнить два анализов, используется для изучения клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и оптимизированный в vitro видео на базе микроскопа царапин РАН пробирного.
Introduction
Клетки вторжения и миграции участвуют в распространении раковых клеток, который является основной причиной резистентности к лечению1 и может привести к локорегионарной или метастатической рецидива после лечения рака2. Эпителиальный мезенхимальных переход (EMT) является начальный процесс клеток вторжения миграции в котором рака клеток переключиться из эпителиальных мезенхимальных фенотип. E-Кадгерины является внеклеточным маркер эпителиальных фенотипу3, и увеличение выражение N-Кадгерины и виментин характерно мезенхимальных фенотип4. Миграции также зависит от внутренней способности раковых клеток вторгнуться внеклеточного матрикса (ECM) через действие матрицы металлопротеаз5.
Этот механизм вторжения – миграции был описан для рака во многих местах, особенно в головы и шеи рак6. Многие исследователи сосредоточились на процессах миграции и вторжения, чтобы лучше понять, как распространение раковых клеток в надежде на то, что это знание приведет к новой стратегии лечения. Важно, что эти исследования выполняются с использованием надежных и воспроизводимых анализов.
В vitro анализа подвижности клеток может быть сложным. Разработаны много лет назад, Пробирной палаты Бойден считается стандартом для вторжения – миграции анализ7. Однако это занимает много времени и часто неточно. Второй тест является ранозаживляющим пробирного8, которая предполагает принятие царапина на культуру монослоя клеток и захвата изображения клетки вторжения и миграции в фиксированных временных интервалов. Этот метод широко подвергается критике из-за большого различия между результатами двух последовательных испытаний. Однако применение современных технологий, особенно в микроскопии, улучшилась воспроизводимость assay скретч рану. Видео Микроскопы могут быть легко введены в инкубаторы и может генерировать изображения в реальном времени миграции клеток. Эти устройства записи микроскопических данных и автоматического анализа слияния клеток рану со временем. Цель этого документа — для описания Бойден Пробирной палаты и пробирного оптимизированный скретч рану и обсудить преимущества и недостатки каждого подхода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы приводим здесь два различных механизмов для изучения процесса вторжения и миграции клеток. Анализ этого процесса имеет важное значение для понимания факторов, участвующих в метастатических повторения, которые могут быть объяснены повышенной подвижности субпопуляции клеток рака н…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эти методы были разработаны при поддержке LabEx PRIMES (АНР-11-LABX-0063), Contrat план-Etat-региона (CPER) в рамках научных ETOILE (CPER 2009-2013), и лиричные Грант инков-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
Referencias
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
