Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga
Summary
Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.
Abstract
A capacidade de sincronizar as células tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular. Técnicas comuns empregadas incluem privação de soro; produtos químicos que prendam células em fases diferentes de ciclo celular; ou o uso de mitótica shake off-que explora sua aderência reduzida. No entanto, todos estes têm desvantagens. Por exemplo, a fome de soro funciona bem para as células normais, mas menos bem para células tumorais, com pontos de verificação ciclo de celular comprometida devido à perda de supressor de ativação ou tumor do oncogene. Da mesma forma, populações de células quimicamente tratada podem abrigar dano induzido e mostrar alterações relacionadas ao estresse. Uma técnica que contorna esses problemas é elutriation centrífuga de contracorrente (CCE), onde as células estão sujeitos a duas forças opostas, a força centrífuga e a velocidade do fluido, que resulta na separação de células com base no tamanho e densidade. Desde células avançando através do ciclo normalmente ampliar, CCE pode ser usado para separar as células em fases diferentes de ciclo celular. Aqui podemos aplicar esta técnica para as células de leucemia linfoblástica aguda primária. Sob condições ideais, uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases podem ser obtidas em excelente rendimento. Estas populações de células são ideais para estudar mecanismos de ciclo celular dependente da ação de drogas anticâncer e para outras aplicações. Podemos também mostrar como modificações para o procedimento padrão pode resultam em desempenho suboptimal e discutir as limitações da técnica. A metodologia detalhada apresentada deve facilitar a aplicação e exploração da técnica para outros tipos de células.
Introduction
Células cultivadas geralmente crescem de forma assíncrona e células individuais estão presentes em diferentes fases do ciclo celular. Alguns organismos apresentam ciclos de célula naturalmente síncronos ou podem ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por exemplo, núcleos dentro plasmódios gigantes do slime molde Physarum polycephalum dividem em uma forma altamente síncrona1e as células das algas verdes que desmodesmus quadricauda podem ser sincronizados por alternadas claras e escuras períodos2. Embora esses organismos oferecem atributos únicos experimentais, são modelos inadequadamente as complexidades de células de mamíferos. A capacidade de sincronizar artificialmente as populações de células de mamíferos tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular e a base molecular dos postos de controlo do ciclo celular. Métodos comuns incluem privação de soro, bloco de químico e liberação ou explorando características físicas3,4. Retirada do soro, muitas vezes, faz com que células entrar quiescência, e a re-adição de soro promove ciclo celular reentrada para o G1 fase5. Inibidores químicos incluem agentes como timidina excesso hidroxiureia que bloqueiam as células no limite do G1/S ou inibidores de microtúbulos que tipicamente prendam células na fase M3,4. Abordagens que exploram características físicas incluem mitótica shake off-que pode ser usado para enriquecer para células mitóticas desde que eles são menos aderentes que interfase células6. No entanto, todas essas técnicas têm desvantagens potenciais. Por exemplo, nem todos os tipos de célula mantêm viabilidade na ausência de soro ou a presença de inibidores químicos e o rendimento das células após agitar-off mitótica é limitado sem prévia sincronização com inibidores mitóticos.
Com excepção dos primeiros ciclos de celular embrionários, onde células progressivamente diminuem de tamanho, como eles dividem7, a maioria das células, avançando através do ciclo passam por fases de crescimento e se tornam maiores. Esta propriedade é explorada na técnica de elutriation centrífuga contrafluxo (CCE), que pode ser usado para separar as células diferindo em tamanho e, portanto, no ciclo celular fase8,9. Durante CCE, as células estão sob a influência de duas forças opostas: a força centrífuga, que leva as células longe do eixo de rotação e a velocidade do fluido (contrafluxo), que leva as células para o eixo de rotação (Figura 1). Células na câmara elutriation alcançar uma posição de equilíbrio onde estas forças são iguais. Os principais fatores que ditam a posição de equilíbrio são a densidade e diâmetro da célula. Como o fluxo taxa da solução-tampão é aumentada e a força de arrasto de contrafluxo supera a força centrífuga, é estabelecido um novo equilíbrio, causando uma mudança na posição de células dentro da câmara. Todas as células são deslocadas na direção de saída da câmara, resultando em menores deixando a câmara, em primeiro lugar, Considerando que as maiores células permanecer dentro da câmara até que a taxa de contrafluxo é aumentada suficientemente para promover sua saída. As células escapar da câmara de elutriation com aumentos consecutivos na taxa de contrafluxo podem ser coletadas em frações específicas e cada fração contém células de tamanhos que aumentam sequencialmente. Em vez de realizar elutriation com aumentos incrementais em taxa de contrafluxo, sequencial diminui em força centrífuga, diminuindo a velocidade de centrifugação irá realizar o mesmo resultado. O processo de elutriation exige otimização dependendo do tipo de célula, buffer de elutriation empregado e o aparelho específico utilizado. A taxa de sedimentação de células nestas condições é melhor descrita pela lei de Stokes: SV = [d2(ρp– ρm) / 18η] .ω2r, onde SV = velocidade de sedimentação; d = diâmetro da partícula; Ρ,p = densidade da partícula; Ρm = densidade do buffer; Η = viscosidade do buffer; Ω = velocidade angular do rotor; e r = posição radial da partícula. Assim, o SV é proporcional à densidade e diâmetro da célula, e desde que o diâmetro é elevado à segunda potência, contribui mais significativamente do que a densidade que é geralmente constante ao longo do ciclo celular.
Uma vantagem importante da CCE é que as células não estão sujeitos a condições adversas de tratamento químico ou privação nutricional e podem ser recuperadas em excelente rendimento essencialmente imperturbável. Um requisito é que as células em questão se submeter a um aumento significativo de diâmetro, pelo menos 30%, como eles atravessam o ciclo celular. A principal desvantagem é o custo do centrifugador especializado, rotor e acessórios. No entanto, a capacidade de preparar células enriquecidas nas fases do ciclo celular específico por CCE tem facilitada pesquisa do ciclo celular em organismos do fermento para células de mamíferos9,10. Além disso, os avanços recentes estão expandindo usos para a separação das células de saudável contra o tecido canceroso, a separação dos diferentes tipos de células em misturas heterogêneas e a produção de tipos de células específicas para imunoterapia9.
Nosso interesse principal tem sido na compreensão do mecanismo de ação do microtubule direcionamento MTAs (agentes) tais como alcaloides da vinca e taxanos. Estas drogas foram pensadas para atuar exclusivamente na mitose, bloqueando os microtúbulos do fuso função11,12, mas a evidência recente sugere que eles também podem direcionar interfase microtúbulos13,14. Recentemente, informou que as células de leucemia linfoblástica aguda primária (todos) sofrem a morte em qualquer fase G1 ou no M fase quando tratados com vincristina e outros MTAs em uma maneira dependente do ciclo celular15. A habilidade de separar todas as células em fases diferentes de ciclo celular por CCE foi fundamental para chegar a esta conclusão. Neste artigo, descrevemos os detalhes técnicos e oferecer dicas práticas para a aplicação da CCE para a preparação da escola primária de todas as células nas fases do ciclo celular diferente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método de obtenção primária todas as células em diferentes fases do ciclo celular usando o CCE. Sob condições ideais uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases prontamente poderiam ser obtidos em excelente rendimento, e células altamente enriquecidas em fase S também podem ser obtidas se desejado. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando um primário de que toda cultura (especificamente, ALL-5) e essencia…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH CA109821 (para o TCC). Agradecemos Beckman-Coulter, generosamente, fornecendo recursos para cobrir os custos de publicação e de assistência técnica na instalação e operação do sistema elutriation. Agradecemos o Dr. Fred Falkenburg pelo fornecimento inicial primária todas as culturas.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
Referencias
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