Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Summary

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Abstract

En raison de sa formidables outils pour les études de génétique moléculaire, Arabidopsis thaliana est une des espèces plus en vue de la modèle en biologie végétale et, surtout, en biologie de la reproduction végétale. Cependant, plante morphologique, anatomique et les analyses ultrastructurales comprennent traditionnellement beaucoup de temps l’incorporation et la section procédures de champ lumineux, balayage et au microscope électronique. Les progrès récents dans la microscopie confocal fluorescence, state-of-the-art 3D analyses microscopiques assistée par ordinateur et l’amélioration continue des techniques moléculaires pour être utilisé sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à une augmentation de la demande pour développement de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon. Dans ce protocole, les auteurs décrivent les techniques de dissection correctement Arabidopsis fleurs et siliques, base de techniques, de compensation et certaines méthodes de coloration pour toute monture observations des structures reproductrices.

Introduction

Fleurs sont parmi les plus importantes définissant des organes des angiospermes. Plantes dicotylédones est apparu il y a 90 millions ans¹et diversifié si vite que leur apparition rapide a été décrit comme un « mystère abominable » par Charles Darwin,². Les intérêts des chercheurs de l’usine de développement floral sont diverses. Certaines recherches ont porté sur la compréhension de l’origine évolutive de la fleur dans son ensemble, ni l’évolution des propriétés spécifiques d’anatomiques, structurales et fonctionnelles des fleurs^3,4,5,6 . La forte variation dans la forme florale et structure, ainsi que les modes de reproduction sexuée et asexuée, en s’appuyant sur eux, faire la fleur, une structure très complexe. Cela a conduit à divers efforts pour caractériser les éléments d’anatomie et de la structure des organes floraux, en utilisant des techniques microscopiques photonique et électronique qui pourraient être associées à des études génétiques et moléculaires⁷. En outre, comme la source de graines, de fruits et de fleurs sont d’une importance primordiale pour la nutrition humaine et animale. Donc, la caractérisation du développement de fleurs et de fruits a de nombreuses implications pour la recherche appliquée, y compris la sécurité alimentaire d’une population croissante et des stratégies de conservation écologique portant une mutation de l’environnement^{8 , 9 , 10}.

Développement floral chez Arabidopsis commence avec l’induction florale et la transformation du méristème végétatif d’un méristème de l’inflorescence (groupe de fleurs). Fleur primordiums latéralement sur le flanc de l’inflorescence méristème¹¹. Les primordia des organes floraux forment progressivement en verticilles concentriques de l’extérieur vers le centre de la fleur et éventuellement se développent en des sépales, pétales, étamines et des carpelles⁷. Ces organes floraux remplissent distincte nutritive, protectrice et fonctionnelle (par exemple, l’attraction des pollinisateurs) rôles dans différentes espèces de plantes, avec les organes sexuels, soutenir le développement des gamétophytes mâles et femelles, respectivement^{12 , 13}. les gamétophytes, à son tour, chacun différencient une paire de mâles (spermatozoïdes) et des gamètes femelles (oeuf et cellule centrale), qui s’unissent à la double fécondation pour former la prochaine génération, le zygote et l’endosperme primaire, un terminal tissus soutenant le développement de l’embryon^14,15. Développement des fruits et semences de soutenir la croissance, la maturation et la conservation de l’embryon et, éventuellement, sa dispersion. Une recherche approfondie a été effectuée pour caractériser la fleur et l’embryon développement dans diverses espèces végétales, en particulier en l’espèce modèle Arabidopsis^7,16,17.

Des analyses microscopiques au début du développement floral reposaient sur le traitement des échantillons fastidieux et observation techniques, comme la paraffine ou résine enrobage et sectionnant, combiné avec la lumière ou la microscopie électronique. Ces techniques microscopiques traditionnelles étaient souvent utilisés en combinaison avec des enquêtes génétiques moléculaires, comme les analyses microscopiques de mutants, de la localisation de l’ARN par hybridation in situ ou immuno-détection des protéines. Les progrès récents en microscopie à fluorescence à champ large et confocale, dans les analyses de l’état-of-the-art image assistée par ordinateur en 3D et l’amélioration continue des méthodes moléculaires qui peuvent être utilisés sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à un besoin de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon qui sont préférentiellement se prêtent à des analyses quantitatives. Ces dernières années, des progrès significatifs accomplis dans le développement de techniques de compensation sur les animaux spécimen entier-montent. Ils rendent l’échantillon transparent soit en utilisant des réactifs aqueux ou sucre-base d’urée (p. ex., échelle, SeeDB, cubique)^18,19,20, soit en supprimant sélectivement les lipides (en utilisant le détergent SDS) après incorporant des échantillons dans les hydrogels stables ; l’élimination des lipides peut être atteint soit par diffusion passive (p. ex., modification clarté protocole²¹, Pacte-PARS-jantes²²) ou activement par électrophorèse (original clarté protocole²³ et²⁴de la loi-PRESTO). Encouragée par ces progrès rapides, certaines techniques dérivées apparaissent également pour utilisation dans les usines.

Dans cet article de méthodes axé sur le modèle Arabidopsis, nous décrivons la procédure pour la dissection correcte des boutons floraux, les fleurs et les siliques jeunes et l’enlèvement des échantillons entiers pour colorer diverses et les procédures d’observation à l’aide classique ou d’une méthode axée sur le SDS clairière récente. Exemples d’amidon, callose et coloration de la chromatine sont donnés. Bien que ces procédures peuvent besoin de plus d’améliorations et adaptations lorsqu’il est utilisé avec d’autres espèces, nous espérons qu’ils préparera le terrain pour des recherches ultérieures sur ces méthodes simples mais essentielles qui constituent le point de départ de nombreux projets de recherche.

Protocol

1. fleur et la Fixation de la Silique Récolte de fleurs et siliques de plantes synchronisés lors de l’ouverture de la première fleur.Remarque : Dans les conditions expérimentales utilisées ici, les plantes commencent à fleurir environ 21 jours après la transplantation de Murashige et Skoog (MS) des dalles au sol. Graines sont stratifiées pour 3 à 4 jours à 4 ° C et germent/cultivés sur MS plaques à 22 ° C/16 h de lumière et 18 ° C/8 h sombre pendant 8 à 10 jours, avant de transplanter le…

Representative Results

Arabidopsis appartient à la famille des Brassicacées, portant des inflorescences avec des fleurs bisexuées, disposées en corymbe (Figure 1). Chaque fleur comporte quatre sépales, quatre pétales, six étamines (quatre de long et deux courts) et un gynécée syncarpe constitué de deux carpelles congénitalement fusionnés (Figure 1F-H) disposées en verticilles concentriques quatre…

Discussion

L’existence de nombreux boutons floraux au sein d’une inflorescence unique de l’ Arabidopsis, couvrant toutes les étapes du développement de fleur, offre une occasion unique pour les études visant à caractériser l’effet d’un traitement ou d’une caractéristique du développement en même temps à travers les différentes étapes du développement floral. Un bon point de référence entre les différentes plantes individuelles est l’ouverture de la première fleur de l’inflorescence principale….

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.