Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren
Summary
Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.
Abstract
Beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren, een fysiek resistente weefsel met een hoog gehalte aan structurele proteïnen. Ontleed ledemaat spieren van volwassen muizen zijn fysiek verstoord door mechanische homogenisering, of een combinatie van hakken en douncing, in een hypotone buffer voordat formaldehyde fixatie van de cel lysate. De vaste kernen zijn gezuiverd door verdere cycli van mechanische homogenisering of douncing en opeenvolgende filteringen cel puin te verwijderen. De gezuiverde kernen kunnen onmiddellijk of in een later stadium worden sonicated na invriezen. De chromatine efficiënt kan worden sonicated en is geschikt voor chromatine immunoprecipitation experimenten, zoals wordt geïllustreerd door de profielen verkregen voor transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties. De gebeurtenissen van de bindende gedetecteerd met behulp van chromatine bereid door dit protocol zijn overwegend die plaatsvindt in de kernen van de spiervezel ondanks de aanwezigheid van de chromatine van andere vezel-geassocieerde satelliet en endotheliale cellen. Dit protocol is daarom aangepast aan het bestuderen van genregulatie in de skeletspieren volwassen muis.
Introduction
Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine gekoppeld aan kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) en hoge doorvoer sequencing (ChIP-seq) zijn geworden de keuze om te studeren transcriptie en Epigenetische regulatie van de genexpressie in verschillende weefsels en celtypes1. Deze techniek maakt het mogelijk genoom-brede profilering van covalente chromatine wijzigingen, histone variant bezetting en transcriptie factor bindende2,3.
Terwijl het uitvoeren van ChIP uit gekweekte cellen goed ingeburgerd is, blijft ChIP van zoogdieren weefsels uitdagend. Chromatine voorbereiden ChIP bestaat uit verschillende kritische stappen die moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel en cel. Chromatine kan bereid worden uit de cellulaire lysates van gekweekte cellen of volgende zuivering van hun kernen. In het geval van zoogdieren weefsels staan efficiënte lysis, formaldehyde fixatie en reiniging van kernen kritisch tegenover met het oog op een optimale terugwinning van de chromatine. Bovendien moet de keuze of u kunt het oplossen van de kernen, vóór of na hun zuivering experimenteel worden bepaald. Ondanks deze hindernissen, is ChIP met succes uitgevoerd van weefsels zoals de lever, testis of hersenen4,5,6. In het geval van skeletspieren vormt verstoring van dergelijke een fysiek resistente weefsel, dat een hoog gehalte aan structurele proteïnen, en isolatie van de kernen vertoont een bijzondere uitdaging. Gezien deze specificiteit, geven protocollen geoptimaliseerd voor andere weefsels geen bevredigende resultaten voor skeletspieren.
Hier beschrijven we een protocol om te isoleren van de ChIP-grade chromatine van muis skeletspieren weefsel, waarbij het weefsel, formaldehyde fixatie, waarna het isolement van de kernen en ultrasoonapparaat fysiek te verstoren. De efficiëntie van deze methode voor het bereiden van chromatine geschikt voor ChIP uit dit weefsel werd aangetoond door het uitvoeren van ChIP-qPCR en ChIP-seq voor verschillende transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties7.
Deze nieuwe techniek is veel sneller dan een eerder gemelde protocol8 bestaande uit lange collagenase spijsvertering stappen in die periode, wijzigingen in genomic lokalisatie van transcriptiefactoren en wijzigingen in genexpressie kunnen plaatsvinden. De snelheid waarmee de kernen zijn geïsoleerd en vaste maakt de hier beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine waarmee de inheemse genomic bezetting staat meer getrouw worden vastgelegd. Bovendien, hoewel andere methoden voor het chromatine isolatie of eiwit extractie van spierweefsel zijn beschreven8,9,10 en gebruikt voor ChIP-qPCR experimenten op geselecteerde genen, geen ChIP-seq gegevens is gemeld met hen. De methode hier gemeld is geschikt voor transcriptie factor en Histon wijziging ChIP-seq, en moet daarom ook geschikt voor 3 / 4C of HiC chromatine conformatie opname toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een nieuw protocol voor het voorbereiden van de chromatine van volwassen muis skeletspieren en Toon dat deze chromatine is geschikt voor ChIP experimenten die transcription factor binding en covalente histone modificaties in de spiervezel kernen detecteren. Dit protocol omvat verschillende kritische stappen. De eerste is de verstoring van de weefsels die kan worden uitgevoerd hetzij door dounce hetzij door mechanische schuintrekken. Mechanische schuintrekken sneller en meer reproduceerbaar is, en daar…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle medewerkers van de IGBMC hoge doorvoer sequencing faciliteit, een lid van “Frankrijk Génomique” consortium (ANR10-INBS-09-08) en alle IGBMC algemene diensten met name het personeel van de IGBMC dier faciliteit. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de CNRS, de INSERM, de AFM, de Ligue Nationale contre le Cancer, de Franse vermelden Fonds door middel van de ANR onder het programma Investissements d’Avenir geëtiketteerd ANR-10-IDEX-0002-02, de Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 en de ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. SJ werd gesteund door de Ligue Nationale contre le Cancer ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 en de V.U door de Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. ID is een ‘équipe labellisée’ van de Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Referencias
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
