Nous introduisons une in vivo utilisant deux fluorochromes différents pour suivre la dynamiques changements vasculaires de la colonne vertébrale suite à une contusion médullaire chez les rats Sprague-Dawley adultes de méthode d’imagerie.
De la moelle épinière (SCI) provoque une perturbation vasculaire importante sur le site de lésion. Pathologie vasculaire se produit immédiatement après la SCI et se poursuit tout au long de la phase de lésions aiguës. En effet, les cellules endothéliales semblent être le premier à mourir après une SCI contondants. Les événements vasculaires précoces, notamment l’augmentation de la perméabilité de la barrière de sang-la moelle épinière (BSCB), induisent un oedème vasogénique et contribuent aux manifestations néfastes lésion secondaire causées par des mécanismes complexes de blessures. Ciblant les perturbations vasculaires, par conséquent, pourrait être une stratégie clé pour réduire les cascades de lésion secondaire qui contribuent à des déficiences histologiques et fonctionnelles après LMÉ. Des études antérieures ont été principalement effectuées sur des échantillons post mortem et étaient incapables de capturer les changements dynamiques du réseau vasculaire. Dans cette étude, nous avons développé une en vivo duo-color biphotonique méthode d’imagerie pour surveiller des changements dynamiques vasculaires aiguës après contusion Sci. Cette approche permet de détecter la circulation sanguine, le diamètre du vaisseau et autres pathologies vasculaires à divers endroits du rat même avant et après l’accident. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une excellente occasion pour étudier la dynamique vasculaire.
Traumatismes de la moelle épinière (SCI) est une blessure courante menant à l’affaiblissement de la fonction de moteur, sensorielle et autonome. Selon le National moelle épinière lésions statistique Center (NSCISC) en 2016, environ 282 000 personnes ont été touchées alors que 69 % d’entre eux étaient principalement dus à des accidents de la circulation ou tombe1. Ces patients nécessitent souvent des soins intensifs ; Cependant, aucun traitement efficace n’est actuellement disponible. Par conséquent, les nouvelles stratégies efficaces vers SCI sont urgent.
SCI est principalement divisé en deux phases : lésions primaires et lésion secondaire. La lésion primaire comprend l’insulte physique provoquant une nécrose hémorragique au point d’impact2, suivie d’une série d’événements de lésion secondaire, telles que l’inflammation et l’apoptose des cellules démyélinisation des axones restants, qui conduisent progressivement l’expansion des déficits fonctionnels et morphologiques3,4,5,6. L’hémorragie est le premier signe visible de blessure, ce qui indique un perturbation vasculaire immédiat dans la phase aiguë de la SCI7,8. Une stratégie de neuroprotecteur vise à réduire les blessures vasculaires précoces pourrait améliorer la récupération des patients, mais cela requiert une meilleure compréhension du mécanisme physiopathologique des événements vasculaires précoces après l’accident.
Malgré des études antérieures à l’aide de diverses méthodes pour étudier la vascularisation de la moelle épinière, des limitations importantes demeurent. L’inconvénient plus partagé étudie que des échantillons post mortem, par exemple, de dégagement d’hydrogène9, autoradiographie,10, microangiogram8, corrosion vasculaire moulages11et immunohistochimie12 ,,13. Bien que la débitmétrie Doppler Laser assure un suivi en temps réel non invasive de la moelle épinière sang écoulement14, il est impossible de différencier les systèmes vasculaires et de détecter des changements morphologiques vasculaires. Dynamique contraste accentué IRM (IRM-DCE) est également non invasive, mais elle génère des images basse résolution et nécessite une infrastructure coûteuse15.
Bien qu’ in vivo d’imagerie utilisant 2 photons laser microscopie (2p-LSM) a été développé pour l’étude de vasodynamics dans le cortex16,17,18, un nombre limité d’études ont démontré des changements vasculaires suite à une SCI. Tang et al. ont montré des changements dans la circulation sanguine au bord de l’emplacement de la lésion dans une hémisection modèle19, mais l’imagerie après qu’une blessure à la contusion est plus difficile pour deux raisons. Tout d’abord, une fenêtre optique en verre traditionnel sur le site de la lésion ne serait pas soutenir l’impact mécanique et restent fonctionnelle pour l’imagerie. Deuxièmement, les fuites de traceur dans le parenchyme dû à hémorragie crée des difficultés avec l’imagerie après l’accident.
Nous présentons ici une méthode d’imagerie roman duo-color, qui permet l’imagerie les navires individuels mêmes aux périodes avant et après l’accident. En outre, il fournit un profil temporelles et spatiales des changements dynamiques vasculaires, suite à une contusion Technol Il a également le potentiel pour l’imagerie à plusieurs moments après l’accident. Ce protocole peut être directement appliqué aux animaux transgéniques pour étudier les interactions neurovasculaires.
Un défi pour les études vasculaires à la suite de SCI est la limitation technique parce que les techniques traditionnelles sont en grande partie limités aux modifications de la structure vasculaire dans des échantillons post mortem. Ce roman en vivo imagerie méthode décrite ci-dessus permet de mesure dynamique de la circulation sanguine et de paramètres (diamètre vitesse et bateau) chez des rats vivants à l’aide de 2p-LSM. Il permet également l’examen répétée dans les mêmes jeux de navires à des moments différents après contusion Sci. Les techniques d’imagerie microscopie 2 photons précédentes ont été incapables de capturer les structures vasculaires post-traumatiques en raison de la fuite d’un traceur unique. Notre duo-couleur design permet une imagerie vasculaire dynamique pour les modèles traumatiques. En outre, la flexibilité de cette méthode permet de générer un profil temporelles et spatiales des changements vasculaires aigus suite Sci.
Il y a plusieurs étapes cruciales dans notre de vivo duo-color méthode d’imagerie. Tout d’abord, il est fondamental de s’assurer de la stabilité physique de la moelle épinière avant l’imagerie Time-lapse, particulièrement réduire les artefacts de mouvement respiratoire. Nous avons conçu la forme de la colonne vertébrale serre-joints pour augmenter la hauteur de la colonne vertébrale vertèbre légèrement au cours de la stabilisation. Ainsi le mouvement de la moelle épinière corréler à l’animal de respirer peut être considérablement réduite (Figure 1-F, 2 b). Il est recommandé de vérifier la stabilité de la moelle épinière avant le début de chaque séance d’imagerie. Si la moelle épinière ne parvient pas à atteindre la stabilité, l’ajustement devrait faire l’alignement et le serrage des colliers de serrage de la moelle épinière. Deuxièmement, périphérique tissus (OS, couche de muscle et la peau) saignements dans la fenêtre d’imagerie risque de contamination de la vue. Pour une session de formation image lisse, gelfoam et tissu colle doit être appliquée pour les tissus environnants pour une prévention efficace. Troisièmement, les colorants fluorescents que nous choisissons ont une taille similaire comme l’albumine (66 kDa), qui est la protéine du plasma sanguin principal haut poids moléculaire. Dans des conditions homéostatiques, les colorants ont été largement conservés à l’intérieur du navire similaire comme l’albumine,28. Après la blessure, les colorants traversaient la structure endothéliale perturbée et se sont échappés dans le parenchyme, causant une intensité de fluorescence une augmentation significative dans la zone périphérique du système vasculaire (Figure 3F-G). En outre, il y a deux raisons pour lesquelles nous choisir cathétérisme de la veine jugulaire externe. Tout d’abord, il peut fournir une route constamment accessible de livraison à tout moment de l’expérience. En second lieu, il peut être utilisé comme une voie pour l’injection de traitement futur.
Bien que notre méthode de duo-color in vivo est en mesure de fournir un nouveau lieu de rendez-vous pour les études d’imagerie vasculaires traumatiques, certaines réserves au sujet de cette technique doivent être abordées. Actuellement, cette technique vise à évaluer les changements vasculaires à 2 points dans le temps (base et 1 point de temps après l’accident), mais il est possible de passer à plusieurs points dans le temps, si les canaux et autres colorants fluorescents est disponibles. Il existe plusieurs études utilisant Vitre implanté pour l’imagerie intravitale chronique, aucun d’eux ne peut fournir de l’information de base sur le même navire après traumatisme19,29,30, 31,32. Contrairement à ces études, notre fenêtre est une fenêtre non-verre. C’est commode pour l’imagerie avant et après l’accident, mais il peut être difficile pour rétablir la fenêtre d’observation à long terme. Nos recherches futures travaille à l’amélioration technique d’imagerie chronique. Le système vasculaire est composé de plusieurs types de vaisseau (artère, veines et capillaires) et chacun est différent dans les aspects de la morphologie et la fonction. Différenciation entre les types de bateaux en imagerie pourrait aider à cerner une tendance claire des changements vasculaires. Le protocole ci-dessus dépend de l’observateur, indication des navires basés sur la morphologie et de la vitesse ; Toutefois, un colorant artère spécifiques peut être facilement ajouté pour donner une classification plus définitive entre types de navire33.
Cette technique est non seulement limitée aux évaluations sur contusion et autres modèles traumatiques, comme blessure par écrasement et rayonnements des blessures, mais également sur des études qui portent sur la perturbation des BSCB, perméabilité ainsi que vasculaire change. En plus de la SCI, il pourrait être utilisé pour étudier les changements vasculaires à la suite d’autres maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la sclérose en plaques (MS). En outre, il pourrait être transférable à un modèle animal transgénique pour étudier l’interaction dynamique neurovasculaire. Comme outil de dépistage puissant, les études futures pouvaient utiliser la technique d’imagerie décrite ici pour évaluer l’efficacité du traitement de la moelle épinière.
En conclusion, méthode de duo-color in vivo est un outil fiable et en temps réel, le in vivo approche pour évaluer les changements vasculaires dynamiques, ce qui est idéal pour la caractérisation du profil vasculaire temporelles et spatiales et de dépistage pour les traitements à réduire les dommages secondaires suite Sci.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 mérite examen prix I01 BX002356 du US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana, la moelle épinière et Brain Injury Research Foundation ( ISCBIRF) Indiana State Department of Health (019919), des fonds de dotation Mari Hulman George.
Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
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Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
ImageJ | Image analysis software | ||
Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |