ويصف هذا البروتوكول طريقة جديدة للتحقيق في شكل من أشكال نيوروستيموليشن الكيميائية من ووليماونت الفئران شبكية العين في المختبر مع غلوتامات العصبي. نيوروستيموليشن الكيميائية يعتبر بديلاً واعداً نيوروستيموليشن الكهربائية التقليدية من الخلايا العصبية الشبكية لعلاج لا رجعة فيه العمى الناجم عن الأمراض التنكسية مستقبله.
علم الأمراض التنكسية يسبب العمى لا يمكن إصلاحه عن طريق الفقدان التدريجي لخلايا مستقبله في الشبكية. هي الأطراف الاصطناعية الشبكية معاملة ناشئة لعلم الأمراض التنكسية التي تسعى إلى استعادة الرؤية بشكل مصطنع تحفيز الخلايا العصبية الشبكية الباقين على قيد الحياة على أمل الحصول على الإدراك البصري مفهومة في المرضى الذين. الأطراف الاصطناعية الشبكية الحالية أثبتت النجاح في استعادة الرؤية المحدودة للمرضى باستخدام صفيف أقطاب كهربائياً تحفيز الشبكية ولكن تواجه حواجز مادية كبيرة في استعادة عالية الحدة، الرؤية الطبيعي للمرضى. نيوروستيموليشن الكيميائية باستخدام أجهزة الإرسال العصبية الأصلية هو حفز المحاكاة البيولوجية بديلة للكهرباء، ويمكن تجاوز القيود الأساسية المرتبطة بالأطراف الاصطناعية الشبكية باستخدام نيوروستيموليشن الكهربائية. على وجه التحديد، نيوروستيموليشن الكيميائية لديها القدرة على استعادة الرؤية أكثر طبيعية مع أكويتيس البصرية مماثلة أو أفضل للمرضى عن طريق حقن كميات ضئيلة جداً من أجهزة الإرسال العصبية، العوامل الطبيعية نفس الاتصال المستخدمة من قبل الشبكية سينابسيس الكيميائية، في قرار أكثر دقة بكثير من الأطراف الاصطناعية الكهربائية الحالية. ومع ذلك، هناك كنموذج تحفيز غير مستكشفة نسبيا، لا بروتوكول المنشأة لتحقيق التحفيز الكيميائي لشبكية العين في المختبر. والغرض من هذا العمل هو توفير إطار تفصيلي لتحقيق التحفيز الكيميائي الشبكية للمحققين الذين يرغبون في دراسة إمكانات neuromodulation الكيميائية الشبكية أو ما شابه الأنسجة العصبية في المختبر. في هذا العمل، نحن وصف الإعداد التجريبية ومنهجية لاستخلاص العقدة الشبكية الخلية (كمبوديا) سبايك ردود مماثلة للبصرية الخفيفة الردود في البرية من نوع ومستقبله-وتحولت ووليمونت الفئران شبكية العين عن طريق حقن تسيطر وحدات التخزين من غلوتامات العصبي في الفضاء سوبريتينال استخدام الزجاج ميكروبيبيتيس وجهاز مخصص موائع جزيئية متعددة المنافذ. هذه المنهجية والبروتوكول عامة كافية تكييفها ل neuromodulation باستخدام أجهزة الإرسال العصبية الأخرى أو حتى غيرها من الأنسجة العصبية.
علم الأمراض التنكسية، مثل التهاب الشبكية الصباغي، والمتعلقة بالعمر البقعي، هي أهم أسباب فقدان البصر القابلة للتوريث و غير قابل للشفاء حاليا1،2. على الرغم من أن هذه الأمراض تنشأ من مجموعة متنوعة من طفرات وراثية محددة، تتميز الأمراض التنكسية مستقبله كمجموعة بالفقدان التدريجي لخلايا مستقبله في الشبكية، مما يسبب العمى في نهاية المطاف. فقدان photoreceptors المشغلات على نطاق واسع يعيد البناء في جميع أنحاء الشبكية ولكن الباقين على قيد الحياة الخلايا العصبية الشبكية، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب ورجكس، تظل سليمة ووظيفية نسبيا حتى في مراحل متقدمة من مستقبله تنكس3 ،،من45،،من67.
الآليات والأسباب المرضية لهذه الأمراض قد اتسمت أيضا3،،من45،،من67 ولكن علاج فعال لا يزال بعيد المنال. على مدى العقود الثلاثة الماضية، والباحثين في جميع أنحاء العالم حققت مجموعة متنوعة من العلاجات العلاجية لاستعادة الرؤية لأولئك المصابين بالأمراض التنكسية مستقبله بما في ذلك الجينات العلاج8، الخلايا الجذعية العلاج9، زرع الشبكية10، و11،التحفيز الاصطناعي12 من الخلايا العصبية الشبكية الباقين على قيد الحياة. هذه هي آخر سريرياً المتاحة الاصطناعية الشبكية، وهي أجهزة نيوروستيموليشن الاصطناعية التي استخدمت تقليديا صفيف من الأقطاب الكهربائية لتحفيز خلايا ثنائية القطب أو رجكس كهربائياً في أنماط محددة بهدف إنشاء التصورات البصرية مصطنعة في11من المرضى. تركيبات كهربائية الجيل الحالي، مثل “ارجوس الثاني”13 وأجهزة14 ألفا–نظام الرصد الدولي، حققت موافقة السريرية والدراسات الأولية قد أشارت إلى أنها يمكن أن تحسين نوعية الحياة للمرضى باستعادة مقياس للرؤية باستخدام ابيريتينال (خدمة شبكية العين) وسوبريتينال (خلف الشبكية) مزروع الأجهزة15،16. المجموعات البحثية العالم تعمل على النهوض بالأطراف الاصطناعية الشبكية بعد النجاحات التي تحققت في هذه الأجهزة من الجيل الأول17،،من1819،20 ولكن واجهت صعوبات تصميم بدلة كهربائية قادرة على استعادة الرؤية عالية الذكاء أقل من مستوى العمى القانوني بالمرضى. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تحقيق القرار المكانية أعلى من التي يتيحها الجيل الحالي الكهربائية على الأطراف الاصطناعية يمثل تحديا بسبب تهمة حقن الحد الأقصى، الذي يتطلب استخدام أقطاب كبيرة لحفز بأمان الخلايا العصبية الشبكية على حساب القرار المكانية، أي البصر11،21. وعلاوة على ذلك، زيادة التحفيز الكهربائي محدود لأنه عادة ما يحفز جميع الخلايا المجاورة ويتسبب ذلك التصورات غير طبيعي ومربكة في المرضى، إلى حد كبير لأنها طبيعتها غير طبيعية من تحفيز نموذج21. ومع ذلك، أثبتت النجاحات المبكرة للتحفيز الكهربائي نيوروستيموليشن الاصطناعية التي يمكن أن يكون علاج فعال للأمراض التنكسية مستقبله. وهذا يقودني إلى افترض أن علاج فعال أكثر فقد تكون قابلة للتحقيق بتحفيز الشبكية مع ناقل عصبي المواد الكيميائية والعوامل الطبيعية للاتصالات في الاشتباكات العصبية الكيميائية. وغرض الطريقة المعروضة في هذه الورقة هو استكشاف جدوى التحفيز الكيميائي، الذي يسعى إلى تقليد نظام متشابك الاتصالات بين الخلايا العصبية الشبكية، كما حفز بديلة للكهرباء المحاكاة البيولوجية الطبيعية العلاجية لبدلة شبكية.
ترجمة لمفهوم التحفيز الكيميائي العلاجي لبدلة شبكية كيميائية تعتمد على تنشيط الخلايا العصبية الشبكية المستهدفة مع كميات صغيرة من العصبية الأصلية، مثل غلوتامات، صدر عن طريق موائع جزيئية كيميائيا جهاز يتألف من مجموعة كبيرة من ميكروبورتس في الاستجابة للتحفيز البصري. وبهذه الطريقة، سيكون بدلة شبكية كيميائية أساسا طبقة مستقبله اصطناعية المحاكاة البيولوجية الذي يترجم الفوتونات بطبيعة الحال الوصول إلى الشبكية لإشارات كيميائية. أن هذه الإشارات الكيميائية تستخدم نفس العصبية المستخدمة في الإشارات الشبكية العادي وتحفيز الخلايا العصبية الشبكية الباقين على قيد الحياة من الشبكية تحولت من خلال مسارات متشابك نفس المستخدمة من قبل مسارات الرؤية العادية، البصرية الناتجة يمكن أن يكون تصور تحقيقها من خلال بدلة شبكية كيميائية مقارنة بواحدة أثارت من خلال الجراحات الترقيعية كهربائية أكثر طبيعية ومفهومة. وعلاوة على ذلك، حيث يمكن إجراء ميكروبورتس من خلالها يتم إصدارها العصبية الصغيرة للغاية والمنتشرة بكثافة عالية، على عكس أقطاب كهربائية، قد يكون مادة كيميائية محتملة اصطناعية قادرة على تحقيق تنشيط التنسيق أكثر وأعلى المكانية القرار من بدلة كهربائية. هكذا، وبناء على هذه المزايا المحتملة، بدلة شبكية كيميائية يقدم بديلاً واعداً جداً للأطراف الاصطناعية الكهربائية.
التحفيز الكيميائي لشبكية العين، ولكن تم نسبيا قليلاً استكشاف حتى وقت قريب. وفي حين اتسمت التحفيز الكهربائي للشبكية جيدا على مدى عقود من العمل من خلال المختبر في22،23و في فيفو2423،، والدراسات السريرية13 ،14، دراسات في التحفيز الكيميائي قد يقتصر حصرا على عدد قليل في المختبر يعمل25،26،،من2728. Iezzi وفينلايسون26 وحلمي et al. 27 أثبتت تحفيز ابيريتينال الكيميائية للشبكية في المختبر باستخدام قطب واحد، ومجموعة مولتيليكترودي (MEA)، على التوالي، لتسجيل ردود غلوتامات أثارت الخلايا العصبية الشبكية. في الآونة الأخيرة، رونتري et al. 28 أثبتت تحفيز تفاضلية المسارات الشبكية وتشغيله باستخدام غلوتامات من الجانب سوبريتينال واتفاق بيئي متعدد الأطراف لتسجيل الاستجابات العصبية من مواقع متعددة على الشبكية.على الرغم من أن هذه الأعمال أنشأت مبدئياً إمكانية التحفيز الكيميائي، كذلك الدراسات ضرورية للتحقيق في العديد من جوانب هذا النهج تتجاوز تلك الموجهة حتى الآن25،،من2627 , 28، وضبط معايير التحفيز العلاجي في نماذج حيوانية في المختبر و في فيفو قبل ترجمة هذا المفهوم إلى بدلة شبكية كيميائية كما نوقش أعلاه. ومع ذلك، حاليا هناك لا المنهجية المتبعة لتحقيق التحفيز الكيميائي الشبكية في الأدب وقد لا وصف الطرق المستخدمة في الأعمال السابقة في مثل هذه التفاصيل كما سيكون أساسيا للدراسات ريبليكاتيفي. ولذلك، الأساس المنطقي لهذه الورقة أساليب لتوفير إطار محدد جيدا لتجري في المختبر الكيميائي التحفيز الشبكية لهؤلاء المحققين المهتمين في تكرار أما أعمالنا السابقة الدراسات27، 28 أو زيادة تعزيز هذا المفهوم الناشئ من نيوروستيموليشن الكيميائية.
هنا نظهر أسلوب إجراء في المختبر الكيميائي تحفيز الخلايا العصبية الشبكية في شبكية العين ووليمونت الجرذان البرية من نوع وطراز الفئران تحولت مستقبله الذي يحاكي عن كثب تطور علم الأمراض التنكسية الأمراض في البشر. الأساس المنطقي وراء تطوير هذا الأسلوب التحفيز في نماذج في المختبر هو تقييم النطاقات العلاجية المختلفة تحفيز المعلمات ودراسة خصائص الاستجابة العصبية التي سيكون من المستحيل أو من الصعب مراقبة في في فيفو النماذج، لا سيما من خلال الدراسات الأولية التي ركزت على تقييم جدوى هذا النهج. في هذا الإجراء، نعرض المتزامنة وموقع واحد موقع متعدد التحفيز الكيميائي لشبكية العين بتسليم كميات صغيرة من غلوتامات 1 ملم قرب الخلايا العصبية الشبكية المستهدفة عن طريق ميكروبيبيتيس زجاج أحادي المنفذ المتوفرة تجارياً ومخصص جهاز متعدد المنافذ موائع جزيئية ميكروماتشينيد، على التوالي. حين إنجاز التحفيز على حد سواء من موقع واحد ومواقع متعددة والهدف الأساسي من التحقيق في جدوى علاجية نيورومودوليشن الكيميائية، كل تخدم غرضاً متميزة مع ميزة فريدة من نوعها. تنشيط موقع واحد، الذي يمكن أن يتحقق مع ميكروبيبيتيس الزجاج سحبت مسبقاً المتوفرة تجارياً، يمكن استخدامها لحقن المواد الكيميائية مباشرة في الطبقة تحت السطحية لشبكية العين في موقع واحد ويقدم للتحقيق في حالة كمبوديا يمكن ملاحظتها ارتفاع معدل يمكن أثارت ردود مشابهة لردود الضوء بصريا مقولة فوكالي تحت موقع الحقن. من ناحية أخرى، يمكن استخدامها لحقن المواد الكيميائية مكانياً في مواقع متعددة على سطح الشبكية التحفيز متعددة المواقع، الأمر الذي يتطلب جهاز موائع جزيئية متعددة المنافذ خصيصا ملفقة، ويقدم للتحقيق في كيفية الغلوتامات أثارت RCG أنماط الاستجابة تتوافق مع أنماط حقن غلوتامات في نمط الدراسات التحفيز.
الطريقة المعروضة هنا يوضح نموذج تحفيز العصبية فريدة من نوعها، حيث يتم تحفيز الخلايا العصبية الشبكية كيميائيا عن طريق حقن المواد الكيميائية العصبي الأصلية في الطبقة تحت السطحية لشبكية العين في المختبر. يوفر هذا الأسلوب التحفيز الكيميائي العديد من الفوائد عبر تقنية التحفيز الكهربائ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيده المعروضة في الورقة العمل “المؤسسة الوطنية للعلوم”، الحدود الناشئة في مجال البحوث والابتكار (NSF-أفري) برنامج منح رقم 0938072. محتويات هذه الورقة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لجبهة الخلاص الوطني. الكتاب أيضا نود أن نشكر الدكتور سامسون حلمي لعمله في تصميم واختبار الإعداد التجريبية الأولى للتحفيز الكيميائي والسيد اشوين راغوناثان لعمله تصميم واختلاق، وتقييم الجهاز موائع جزيئية متعددة المنافذ المستخدمة في هذه الدراسة.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |