שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה
Summary
מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.
Abstract
צריכת מזון הוא תחת שליטה הדוקה של המוח, אשר משלב את מצב פיזיולוגי, palatability ותוכן התזונתיים של המזון, וכן בעיות פקודות כדי להפעיל או להפסיק האכלה. פענוח התהליכים שבבסיס בקבלת ההחלטה של מתון האכלה נושאת השלכות עיקריים בהבנה שלנו של הפרעות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות הקשורים האכלה שליטה ובמועד. שיטות פשוטות, כמותיים, חזקים נדרשים למדידת בליעה מזון בעלי חיים לאחר מניפולציה ניסויית, כגון בכפייה הגברת הפעילות של הנוירונים יעד מסוימים. . הנה, הצגנו מבוסס-צבען תיוג מבחני האכלה כדי להקל על המחקר neurogenetic של האכלה שליטה ב זבובי פירות למבוגרים. אנחנו סקור מבחני האכלה זמין ולאחר מכן לתאר את השיטות שלנו שלב אחר שלב מהגדרת ניתוח, המשלבים thermogenetic, optogenetic מניפולציה של נוירונים שליטה מוטיבציה האכלה עם assay צריכת מזון התווית על-ידי צבע. נדון גם את היתרונות והמגבלות של השיטות שלנו, לעומת מבחני האכלה אחרים, כדי לסייע לקוראים לבחור וזמינותו המתאים.
Introduction
לכימות בכמות האוכל בלע חשוב להערכת מספר היבטים של האכלה הפקדים על-ידי המוח כתגובה לאסונות לצרכים פנימיים (כגון הרעב הברית), גורמים חיצוניים (כגון איכות מזון ו palatability)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. בשנים האחרונות, המאמצים של פיענוח של סובסטרטים עצבית של האכלה שליטה בדרוזופילה להוביל להתפתחות של מבחני מרובים כדי לכמת את כמות המזון בלע במישרין לשמש בתור מדד של האכלה מוטיבציה 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
12,assay13 נימי מזין (CAFE) פותחה כדי למדוד את כמות הצריכה של מזון נוזלי ב microcapillary זכוכית. וזמינותו CAFE מאוד רגיש, לשחזור17 ומפשטת את המדידה של צריכת מזון, במיוחד עבור לכימות האכלה לטווח ארוך18. עם זאת, וזמינותו הזה דורש הזבובים לטפס אל קצה microcapillary ולהאכיל הפוך, אשר אינו מתאים עבור כל זנים. בנוסף, מפני הזבובים להיבדק באמצעות וזמינותו CAFE חייב להיות גדלו במזון נוזלי, ההשפעה של אלה תנאים על חילוף החומרים מצב או של תת-תזונה פוטנציאל לגידול נשאר להיות נחושים.
11,assay14 תגובה סיומת חוטם (פי) סופרת את התדירות של תגובות סיומת חוטם לכיוון נגיעות עדינות של המזון טיפות. לכל assay הוכיח היא דרך מצוינת כדי להעריך האכלה המוטיבציה של זבוב, ישבנים השפעת palatability ותוכן של מזון18,19. עם זאת, זה לא כימות ישירה של צריכת כמות.
לאחרונה, פותחה שיטה חצי אוטומטי, המדריך האכלה assay (MAFE)15. ב- MAFE, זבוב קיבוע אחד מוזן באופן ידני עם microcapillary המכיל מזון. בהתחשב בכך חוטם סיומת תגובות וצריכת מזון ניתן לנטר בו זמנית, MAFE מתאים הערכת הערכים התזונתיים ואת ההשפעות של טיפול תרופתי. עם זאת, שיתק זבוב עלול להשפיע לרעה על ביצועיו התנהגותית, כולל האכלה.
בנוסף, לטוס חוטם, גלאי פעילות (FlyPAD)10 פותחה באופן אוטומטי לכמת את התנהגות האכילה. באמצעות מכונת ראייה שיטות, FlyPAD רשומות האינטראקציות פיזי בין זבוב מזון כדי לכמת את התדירות והמשך של הרחבות חוטם כמחוון של האכלה מוטיבציה. FlyPAD מספק גישה תפוקה גבוהה כדי לנטר את התנהגויות האכילה של זבוב חינם-המעבר, הרגישות ואת החוסן של מערכת זו עדיין רחוק להיות מאושרות על ידי יותר מחקרים12.
אסטרטגיות תיוג משמשים לעתים קרובות כדי להעריך אוכל בליעה בזבובים. זה נפוץ כדי תווית המזון עם קליעים נותבים כימי, לאחר האכלה, למדוד את כמות בלע מעקב כדי לחשב את כמות צריכת המזון. קליעים נותבים רדיואקטיביים16,17,20,21,22,23,24,25 לאפשר איתור דרך הקוטיקולה בלי המגון של הזבובים. בשיטה זו מספק השתנות נמוך להפליא, רגישות גבוהה18, ריאלי עבור לימוד לטווח ארוך של צריכת המזון. עם זאת, הזמינות של רדיואיזוטופים שמיש, תעריפים שונים של ספיגת, והוצאת צריכים להילקח בחשבון כאשר עובדים עם זה וזמינותו.
תיוג והמעקב צריכת המזון בצבעים שאינם רעילים מזון הוא פשוטה ובטוחה אלטרנטיבית2,3,26,27,28. זבובים הם הומוגני לאחר האכלה עם מזון המכיל צבעי מסיסים ולא נספגים, ואת כמות צבע בלע זה מאוחר יותר לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים3,24,28,29 . אסטרטגיית תיוג הוא קל לביצוע, ומספק יעילות גבוהה, אבל עם אזהרה. הנפח של צריכת המזון מוערך מן לצבוע בלע הוא קטן יותר מאשר אמצעי האחסון בפועל כי הפרשה מתחילה מוקדם ככל 15 דקות לאחר זבובים יתחילו להיות. ניזונים17. בנוסף, וזמינותו מעריך בליעה מזון בדרך כלל תוך תקופה של 60-מין, אשר מתאים רק לחקירה לטווח קצר האכלה התנהגות24,28. יתר על כן, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים, כגון גנוטיפ17, מגדר17, הזדווגו המדינה17, לגידול צפיפות30,31,שעון ביולוגי32ומזון איכות3 , 8 , 16, צריכת המזון השפעה. לכן, ייתכן משך ההאכלה צריך להיות מותאם על פי תנאים מסוימים ניסיוני. מלבד בהנחיה כימות של צריכת מזון וצבעי מאכל משמשים גם כדי להעריך אוכל בחירות2,19,27, וכדי להמחיש את מניסקוס ב microcapillary CAFE assay12.
כאן, אנחנו מציגים מניפולציה פרוטוקול בשילוב של פעילות. עצבית בגישה תיוג-צבע. אסטרטגיה זו כבר הוכיח שימושי במחקר שלנו neurogenetic על האכלה שליטה זבובי פירות למבוגרים24. שיטת הניקוד ויזואלי מאפשר הערכה מהירה של צריכת מזון; לפיכך, מומלץ להקרנה דרך מספר רב של זנים במועד. המועמדים מן המסך ואז מאבחנים בפירוט באמצעות שיטה ערכי צבע מוחלטים לספק אובייקטיבית, כימות מדויק במחקר נוסף.
חוץ מזה מבחני האכלה, נתאר גם thermogenetic27,33,34,35 ו- optogenetic36 שיטות בכפייה הפעלת נוירונים היעד בדרוזופילה. כדי להפעיל את הנוירונים מאת thermogenetic המבצע היא פשוטה ונוחה עם דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים Ankyrin 1 (dTRPA1), אשר הוא הקטיון טמפרטורה – ו ממותגת מתח ערוץ זה מגביר דעתנית עצביים כאשר הסביבה הטמפרטורה עולה מעל33,23 ° C37; עם זאת, בדיקות חיות בטמפרטורות גבוהות עשוי לייצר השפעות שליליות על התנהגות. גישה יעילה אחרת כדי להפעיל את הנוירונים בדרוזופילה משתמש optogenetics עם CsChrimson36, אשר הוא אדום-העביר גרסה של channelrhodopsin זה מגביר את רגישות של נוירונים לאור. Optogenetics מציע רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, פחות הפרעה התנהגויות מאשר thermogenetics. שילוב של מדידה כמותית של צריכת המזון עם המניפולציה של פעילות. עצבית מייצג גישה יעילה ללמוד את המנגנונים העצביים של האכלה.
נתאר בפירוט את הכנת האכלה החדר וזבובים להיבדק. באמצעות זבובים טאוטי-Gal4 כמו דגם24, אנו מתארים את הפעלת נוירונים באמצעות thermogenetics ו- optogenetics. שני מבחני של כימות של צריכת מזון עם התווית על-ידי צבע אוכל מתוארים גם בפרוטוקול.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו ח זה יעסוק על תהליך טכני של תיוג לצבוע מבחני האכלה של צריכת מזון בהקשר של thermogenetic ושליטה optogenetic ההפעלה לתמרן נוירונים האכלה. פרוטוקול זה פשוטה ואמינה יעזור להבהיר את הפונקציה של המועמד נוירונים בהאכלה שליטה, כדי למדוד את העדפת מזון זבובים, וכדי לזהות שחקנים הרומן המעגלים שליטה האכלה באמ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2012CB825504), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (91232720 ו- 9163210042), האקדמיה הסינית של מדעי (CA) (GJHZ201302 ו- QYZDY-דר-מז-SMC015), ב”אהבה תוכנית קרן (OPP1119434), ו- 100-כשרונות של רשויות אישורים כדי ז’ו י’.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
Referencias
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
