Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Summary

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Abstract

Detergentes são indispensáveis para a entrega das proteínas de membrana em vesículas de pequenas unilamellar 30-100 nm, enquanto bilayers do lipid modelo maiores, mais complexos, são menos compatíveis com detergentes.

Aqui nós descrevemos uma estratégia para contornar esta limitação fundamental usando fusogenic opostas cobrado lipossomas tendo uma proteína de membrana de interesse. Fusão entre tais vesículas ocorre dentro de 5 min em um buffer de baixa força iônica. Lipossomas de fusogenic positivamente carregado podem ser usados como vetores de transporte simples para entrega livre de detergente de proteínas de membrana em biomimetic bilayers lipídica de alvo, que são carregadas negativamente. Também mostramos como reconstituir as proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes com um protocolo rápido 30 min.

Combinando essas duas abordagens, demonstramos uma montagem rápida de uma cadeia de transporte de elétrons, que consiste de duas proteínas de membrana de e. coli, um próton primário bomba bo₃-oxidase e F₁F_o ATP sintase, nas membranas celulares das vesículas de vários tamanhos, variando de 0,1 a > 10 mícrons, bem como a produção de ATP por essa cadeia.

Introduction

Functionalization de bilayers do lipid artificial com proteínas da membrana é um passo fundamental na montagem de sistemas de membrana modelo. O modelo mais simples, proteoliposomes (PL), consiste de pequenas (30-200 nm de diâmetro) unilamellar vesículas (SUV, também chamados lipossomas), com proteínas integrados em suas membranas. PL formam-se tradicionalmente em duas etapas¹. Primeiro, pré-formadas SUV são misturados com uma proteína de membrana de interesse e um detergente em concentrações acima de sua concentração crítica micelle (CMC). Em segundo lugar, o detergente é removido com diálise, “bio-beads” ou gel filtração técnicas diferentes, deixando a proteína na membrana. A última abordagem é muito mais rápido (~ 30 min¹) e, portanto, é preferível para reconstituição das proteínas de membrana frágil e sensível, enquanto as duas primeiras abordagens são limitadas pela velocidade de remoção do detergente, que leva muitas horas e pode causar um substancial perda de atividade e perda da integridade estrutural das proteínas. Functionalization de grandes vesículas (unilamellar grandes vesículas, LUV, até 1 µm de diâmetro) por esta abordagem é mais desafiador, como vesícula tamanho fica reduzido após a remoção do detergente, e não é possível para vesículas unilamellar gigante (GUV, > 1 µm), como eles são desestabilizado por detergentes (mas veja Johnson et al . ² para 2D-cristalização lenta das proteínas de membrana em grandes bilayers). Abordagens alternativas para chefe da membrana functionalization^3,4,5 existem mas são trabalhoso, demorado e ainda exigem um pouco de detergente em concentrações abaixo de CMC. Mais frágeis ou complexo lipídico modelos (por exemplo, gotículas hidrogel Bilayers⁶ e tecidos artificial para impressão 3D baseados em BICAMADA de Interface da gota⁷) não podem tolerar a detergentes. Emergindo rapidamente aplicações de biologia sintética^8,9,10 criticamente dependem functionalization de tais estruturas complexas de membrana. Portanto, um método fácil e robusto que permite a entrega rápida e suave das proteínas de membrana para os bilayers frágil alvo é muito procurado no campo.

Uma alternativa, método de entrega de proteína livre de detergente é a fusão de vesículas, onde as membranas das vesículas interagindo unem-se na BICAMADA postfusion intacta, enquanto seu conteúdo aquoso intravesicular meter, sem ser liberado para o externo meio ambiente. Fusão de vesículas é habilitado e conduzido por rearranjos conformacionais dentro agentes fusogenic complementares (algumas proteínas^11,12 e peptídeos¹³ ou especialmente modificado DNA¹⁴) localizados na contatar bilayers, ou Coulombic interações entre bilayers do lipid formadas de lipídios catiônicos e aniônicos complementarmente carregado^15,16, ou bilayers catiônicos e proteínas carregadas negativamente¹⁷.

A primeira abordagem exige a presença de agentes fusogenic nas membranas interagindo antes da fusão, é relativamente lenta (~ 30 min para chegar a metade-máximo de fusão^12,18), mas pode ser aplicado a ambos naturais e artificiais membranas.

Uma vantagem da abordagem usando fusogenic lipídios (Figura 1) é que ele permite que muito mais rápida fusão de membrana (~ 1 min para chegar a metade-máximo e 5-10 min para terminar a reação). Além disso, o ponto de fusão pode ser controlado por i) fácil de formular o conteúdo relativo de lipídios carregados em bilayers fusogenic e ii) iônico e, em geral, osmótica força do meio de reação (sais em acima de 50 mM e, por exemplo, sacarose¹⁵ são mostrados para impedir fusão), ou uma combinação de ambos. Para iniciar a fusão, vesículas fusogenic opostas carregadas são misturadas em um meio de força iônica baixa (tipicamente sal 10-20mm) por 5-10 min. Uma desvantagem relativa do método é que lipídios catiônicos podem exercer um efeito negativo sobre a funcionalidade das proteínas de membrana em proteoliposomes catiônica antes da fusão, especialmente em baixa força iônica, mas este efeito é reversível e mitigados por um natural composição lipídica da membrana pós-fusão e seu retorno ao meio de força iônica normal.

Protocol

1. preparação de fusogenic SUV e LUV Preparação da mistura de lipídios fusogenic Preparar soluções estoque de lipídios neutros, catiônicos, aniônicos e fluorescentes no clorofórmio em 25-50 mg/mL (por exemplo, neutro DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), etil-PC catiônica (1,2- dimyristoleoyl-sn-glicero-3-ethylphosphocholine), aniônico POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) e fluorescente colesterol-Bodipy-FL12, respectivamente) por pesagem de quantidades adequadas de lipídios secos e dissolvendo-os em 100% clorofórmio (cuidado! Fazer isso sob uma coifa), ou diluir a existências de clorofórmio comercialmente disponível de lipídios com clorofórmio.Nota: Tanto lipídica natural extrai e lipídios sintéticos puros podem ser usados e demonstram resultados semelhantes. Mix de 2,5 mg uma catiônica e 2,5 mg de um lipídio neutro no estoque de clorofórmio (1.1.1) em um frasco de vidro.Nota: Esta etapa produz 5 mg de mistura de lipídios catiônicos em clorofórmio, contendo fração de peso de 50% de lipídios catiônicos. Quando necessário, adicione 0,5% fração de peso de um lipídio fluorescente à mistura. Misture 1 mg de aniônicos e 4 mg de lípidos neutros em estoques de clorofórmio (1.1.1) em um frasco de vidro. Isto dá 5 mg de mistura de lipídios aniônicos contendo fração de peso 20% de lípidos aniónicos. Evapore o clorofórmio sob um fluxo de nitrogênio para formar uma fina camada de lipídios seco. Remova o clorofórmio residual sob vácuo por 10 min.Nota: Tradicionalmente esta etapa leva muito mais tempo (1-12 h), mas achamos que um tratamento mais não fornece nenhuma melhoria óbvia no acoplamento Propriedades de SUV. Hidrate o filme lipídico seco, adicionando 0,5 mL de tampão A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, MOPS 50 mM, pH 7,4) a cada frasco e deixá-las repousar à temperatura ambiente por 30 min e, em seguida, vórtice até o filme lipídico é completamente separado da superfície de vidro e b te uma suspensão lipídico homogênea. Isso deve levar cerca de 20-40 s. Formação de SUV e LUV por extrusão Montar um sistema de extrusão (consulte a Tabela de materiais) com duas seringas de 1 mL, usando um filtro de policarbonato com um dos seguintes tamanhos de poros: 100 ou 200 nm para formar o SUV e 400 ou 800 nm a forma LUV. Transferi a suspensão lipídico em uma seringa. EXTRUDE a suspensão, passando-o através do filtro 21 vezes, conforme mostrado em outro lugar18,19.Nota: Um número ímpar de passagens é necessário para minimizar a transferência para a solução de vesículas de lipídios grandes aglomerados preso ao lado de filtro, enfrentando a suspensão lipídico original. Transferi a solução de vesículas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. 2. formação de Fusogenic chefe pelo método de emulsão invertida Nota: Este procedimento é ilustrado na Figura 2. Preparação da solução de lipídios em óleo Misture um estoque de clorofórmio (consulte a etapa 1.1.1) de um lipídio neutro (2 mg) e um lipido aniônico (0,5 mg) com 1 mL de hexadecano no tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Evapore o clorofórmio da mistura sob constante mistura e aquecimento a 80 ° C por 30 min, mantendo o tubo aberto. Fechar o tubo e deixe esfriar a temperatura ambiente. Formação de uma monocamada de lipídios na interface de reserva lipídica-em-óleo/aquoso Lugar de 200 µ l da solução de lipídios em óleo em cima 0,5 mL tampão B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, pH de MOPS 10mm 7,4) num tubo de centrífuga 1,5 mL. Observe a forma convexa da borda de separação de fase, devido a tensão superficial de incompatibilidade entre o óleo e o tampão aquoso (Figura 2A). Espere até que nivela a fronteira de separação de fase, que é indicativo de formação de monocamada lipídica nele. Isso normalmente demora 30-60 min à temperatura ambiente. Preparação de uma emulsão de água em óleo Preparar uma solução de um polissacarídeo solúvel em água não-iônico em tampão B, com uma densidade mais elevada do que a densidade da água (por exemplo, 15% Ficoll-400 (p/v), com densidade de 1,05 g/mL)Nota: Opcionalmente, pode-se adicionar corantes fluorescentes solúveis em água para o buffer para melhor visualização do chefe e qualquer outro desejado conteúdo aquoso dos GUVs. Transferi 0,5 µ l da mistura acima para um tubo de centrifugação separados de 1,5 mL com 100 µ l da solução de lipídios em óleo de 2.1.2. Proceda à sonicação (44 kHz em 14 W) a mistura por 30 s em um banho ultra-sônico. Então, vigorosamente vórtice por 45 min formar uma emulsão de água em óleo, onde cada gota será revestida por uma monocamada de lipídios (Figura 2B). Conversão da emulsão água em óleo em chefe Coloque a emulsão resultante em cima a interface lipídio-em-óleo/aquosa e imediatamente centrifugar o tubo em uma centrífuga de mesa a 10.000 x g por 2 min. O sedimento resultante do chefe deve ser claramente visível (Figura 2). Fixe o tubo a 4 ° C no frigorífico para solidificar a mistura da emulsão lipídica (Figura 2D, hexadecano solidifica abaixo de 18 ° C), retire com cuidado o óleo congelado e depois retirar a fase aquosa.Nota: Para facilitar o óleo foi usado remoção congelar um arame dobrado em forma de âncora. Ressuspender o chefe em 50 µ l de tampão fresco B, transferir para um tubo de fresco e inspecionar sob um microscópio de fluorescência usando um 100 objectivo de imersão de óleo X (Figura 2E). 3. fusão de vesículas com cobalto-calceína método de monitoramento Preparação de uma coluna de gravidade de gel filtração. Mergulhe ~ 10 g de uma resina de gel filtração (por exemplo, sephadex superfino G-50) em 100 mL de água desionizada e deixe inchar durante a noite. Pack 3 mL da resina em uma coluna de fluxo de gravidade descartáveis de plástico, lave-o com água ultrapura e equilibrar com tampão C (pH 7,4 de 100 mM KCl, ESPANADORES de 10 mM,) à temperatura ambiente. Preparação de SUV+ ou SUV0 carregado com cobalto-calceína. Preparar uma solução contendo calceína 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, ESPANADORES de 10 mM, em seguida, trazer o pH para 7,4.Nota: A essência do método é que aquele gratuito calceína fluorescente forma um complexo não-fluorescente com Co2 +. Torna-se fluorescente novamente sobre adição de EDTA, que tendo maior afinidade pelo Co2 +, desloca calceína do complexo de cobalto-calceína (Figura 3A). Adicione 500 µ l desta solução para um filme seco de lipídios catiônicos ou neutros, preparados conforme descrito no ponto 1.1. Preparar 100 nm SUV por extrusão conforme descrito no ponto 1.2. Sedimento extrudido SUV a 1.000.000 x g por 20 min em uma mesa se e Resuspenda em 1 mL de tampão C. Repetir a granulação e ressuspensão três vezes; Use 0,6 mL de tampão C para a ressuspensão de ontem.Nota: Estes passos remover a maior parte do cobalto-calceína externo. Remova o restante cobalto-calceína externo passando SUV através de uma coluna de fluxo de gravidade descartáveis carregada com a resina de gel filtração incubada com buffer C conforme descrito por passo 3.1.2.Nota: Nós normalmente descartar o primeiro volume de mililitro do escoamento e coletar o segundo mililitro, que contém cobalto-calceína externo gratuito SUV. Preparação de SUV– carregado com EDTA Prepare a solução de 10 mM de EDTA, 80 mM de NaCl, ESPANADORES de 10 mM, pH 7,4. Adicione 500 µ l desta solução para um filme seco de lipídios aniônicos preparado como descrito no ponto 1.1. Prepare o SUV– por extrusão conforme descrito no ponto 1.2. De pelotas e ressuspender SUV– , conforme descrito em 3.2.4. Remova o restante EDTA passando SUV– através da coluna de gel filtração, conforme descrito no ponto 3.2.5. Preparando o SUV para fusão Diluir o SUV0,+de SUV e SUV– com tampão D (MOPS de 1 mM, pH 7,4) suplementado com 0,2 mM de CoCl2 e a concentração desejada de KCl. Use 5 µ l de cada tipo de SUV por 1 mL de tampão D. Incube a mistura pelo menos 1 h.Nota: Este passo irá minimizar o nível de fluorescência do fundo através do bloqueio de calceína que é superfície limite a SUV+. Fusão de vesículas Começa a reação de fusão misturando-se 1 mL de SUV+ ou SUV0 com 1 mL de SUV− (diluído em tampão D conforme descrito acima) em uma cubeta do fluorímetro de 2 mL e monitor aumento da fluorescência de calceína usando 480 nm de excitação e emissão de 510 nm (Figura 3B). Espere até que a reação vem a conclusão. Adicione uma mistura de detergente Triton X-100 e EDTA (concentração final de 0,05% e 7 mM, respectivamente) para liberar calceína fora de vesículas e obter o sinal de fluorescência máxima. Determine a extensão da fusão definida como a porcentagem do sinal de fluorescência máxima após a adição de detergente, como mostrado na Figura 3. 4. rápida reconstituição das proteínas de membrana em Fusogenic Proteoliposomes Nota: Este procedimento é ilustrado na Figura 4A. Preparar uma coluna de fluxo de gravidade com a resina de gel filtração, conforme descrito em 3.1 e equilibrar isso com tampão à temperatura ambiente.Nota: Todas as manipulações mais devem ser feitas estritamente a ≤ 4 ° C, a menos que indicado de outra forma, para minimizar a perda de atividade da proteína. Ajuste a concentração da proteína purificada de membrana para 0,7 mg/mL diluindo-lo com a mesma solução tampão usado para isolamento de proteína. µ L 140 de mistura da proteína com 300 µ l de SUV pré-formadas, 160 µ l tampão A e 60 µ l de colato de 10% em tampão A; Isto dá 01:30 proteína: relação do peso de lipídios em um volume final de 660 µ l. Agite a mistura em uma plataforma de balanço por 15 min.Nota: As etapas a seguir podem ser feitas à temperatura ambiente. Passe a mistura por meio de resina de gel filtração e coletar frações turvas contendo proteoliposomes. Granule proteoliposomes com uma mesa se a 400.000 x g, durante 15 min. Descartar o sobrenadante contendo a proteína não-reconstituído e resuspenda o pellet em 1 mL de tampão fresco A. Determine o teor de proteínas no PL e o sobrenadante usando o método de Amido-preto20. Determine o rendimento de reconstituição, que normalmente é de cerca de 50-70%.Nota: Passos 4.6-4.8, opcionalmente, podem ser substituídos, passando a solução PL através de 1 mL de resina Ni-NTA embalado em uma coluna de gravidade descartáveis e lavada com tampão A, conforme descrito em 3.1.2. Essa passagem vai separar a proteína não-reconstituído, que será preferencialmente ligada à resina, do PL, a maioria dos quais será na passagem. 5. funcionais testes de atividade da proteína em Proteoliposomes Nota: Ambas as proteínas usadas neste estudo são bombas de prótons poderoso, que bomba H+ em proteoliposomes sobre adição de seus substratos (coenzima Q1 para bo3-oxidase e ATP para F1Fó, respectivamente), assim, a construção um gradiente de protões através da membrana (ΔpH). Em caso de sucesso co reconstituição por fusão, tal acidificação pode ser observada como uma diminuição na fluorescência de uma sonda de pH sensíveis ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, que é usada rotineiramente para tais tarefas ( Figura 4B -C). Além disso substrato específico atividade das proteínas (coenzima Q1 oxidação por bo3-oxidase22 e hidrólise de ATP por F1Fó23,24) pode ser monitorado por espectrometria usando vários métodos. Aqui, demonstramos a atividade de hidrólise de ATP de F1Fo PL usando um ATP Regenerando o ensaio (Figura 4), onde duas enzimas (piruvato quinase (PK) e lactato desidrogenase (LDH) mantém uma concentração constante de ATP como segue. PK recicla ATP através da conversão de ADP produzido por F1Fó volta para ATP, em detrimento de seu substrato fosfoenolpiruvato (PEP). Piruvato, que é um produto desta reação, é convertido em lactato pela LDH em detrimento do NADH, a oxidação dos quais pode ser monitorizada como diminuindo a densidade óptica em 340 nm. Preparação de produtos químicos Prepare-se 1 mM estoque ACMA em etanol. Prepare um estoque de 1 mM de nigericin (ou qualquer outro desacoplador) em etanol. Preparar o estoque de 25mm coenzima Q1 em etanol e estoque de TDT 1m no buffer A. Preparar um estoque de 100 mM de ATP em tampão A e ajustar o pH para 7,4. Prepare estoques de ATP regenerando os componentes do sistema em Buffer r: PEP de 100 mM, 1mm NADH e soluções de PK e LDH em concentração de ~ 500-1.000 unidades/mL. Orientada por oxidação coenzima Q1 próton de bombeamento por bo3-oxidase PL Adicionar 20 µ l de PL para uma cubeta do fluorímetro com tampão de 2 mL A na presença de 0,5 µM ACMA e esperar até o sinal estável usando 430 nm de excitação e emissão de 515 nm. Adicione 40 µM coenzima Q1 para a cubeta. Inicie o bombeamento de prótons adicionando 2 mM DTT PL (Figura 4B).Nota: TDT reduz oxidado coenzima Q1 e torna disponível para bo3-oxidase. Dissipe o ΔpH formado adicionando 2 desacoplador µM (por exemplo nigericin). Sinal de fluorescência ACMA deve retornar rapidamente ao nível quase original.Nota: Não deve haver nenhum ACMA têmpera sobre adição do substrato, se o desacoplador está presente na mistura reacional inicialmente. Próton orientada por hidrólise de ATP bombeamento por F1FoPL Adicione 40 µ l de PL para uma cubeta do fluorímetro conforme descrito em 5.2. Inicie o bombeamento de prótons pela adição de 0,2 mM ATP para PL (Figura 4). Dissipe ΔpH conforme descrito em 5.2.4. Hidrólise de ATP por F1FoPL e sua estimulação pelo desacoplador Adicione 40 µ l de PL de um fluorímetro com 2 mL tampão A, contendo ATP de 1 mM, 0.2 mM NADH, 2mm PEP e 15 µ l cada de PK e LDH. Siga a reação medindo decréscimo de absorbância do NADH a 340 nm. 3-4 min mais tarde, adicionar 2 desacoplador µM para a cubeta para liberar a contrapressão de ΔpH na hidrólise de ATP. A velocidade da reação deve aumentar imediatamente.Nota: PL passada resina Ni-NTA conforme descrito em 4.10 demonstrará o estímulo mais forte pelo desacoplador (Figura 4, vermelho rastreamento), enquanto o eluato será mal estimulado (traço azul). 6. influência do ambiente de lipídios e força iônica na funcionalidade de proteínas de membrana de teste em Fusogenic Proteoliposomes Avaliar o bombeamento de prótons por 40 µ l de PL+,– de PL e PL0 com ensaio de têmpera ACMA em 2 mL de buffer D suplementado com 100 mM KCl (painel B) conforme descrito em 5.2 ou 5.3 (Figura 5 e 20 (Figura 5, painel A) ou 1 mM MgCl2 traços de vermelhos, pretos e azuis). Fusível 40 µ l de PL+ com o mesmo volume de LUV– em 2 mL de tampão D suplementado com 20 mM KCl e teste de ACMA têmpera (verde trace). Execute experimentos de controle como no passo 2, misturando, por exemplo, PL e SUV de mesma carga (traço cinzento).Nota: Bombeamento de prótons deve ser melhorada pelo pl postfusion 7. entrega de proteínas de membrana em LUV e chefe de Fusogenic Proteoliposomes Fusível de 50 µ l de PL+ com 50 µ l de 800 nm LUV– em 1 mL de tampão D suplementado com 1 mM MgCl2e 20 mM KCl por 5 min. As vesículas a 6.000 x g por 5 min de pelotas e descartar o sobrenadante contendo reagido PL+. Resuspenda o pellet em 1 mL de tampão D suplementado com 1 mM de MgCl2 e 100 mM KCl e repetir a granulação e resuspending duas vezes mais. Execute ACMA extinguer ensaio conforme descrito em 5.2 ou 5.4. Execute experimentos de controle, como nos passos 1-3, usando combinações de vesículas carregadas complementares em sal elevada (200 mM KCl), não-fusogenic vesículas e só vazio LUV– sem PL+.Nota: Bombeamento de prótons pelo postfusion LUV deve ser detectado somente quando vesículas complementarmente carregadas foram usadas como mostrado na Figura 6. 8. montagem da cadeia de transporte electrónico de componentes individuais em membranas de LUV e chefe e produção de ATP por essa cadeia. Nota: Um esquema deste procedimento é ilustrado na Figura 7A. ATP produzido neste experimento será registrado pelo sistema luciferina-luciferase, onde a conversão de ATP sintetizado em pirofosfato e AMP por luciferase é seguido por emissão de luz registrado com um luminómetro. Recomendamos usar um único-tubo luminómetro, em vez do luminometers de microplacas menos sensíveis. Mix 3 µ l de bo3-oxidase PL+ e 5 µ l de F1Fo PL+ formaram conforme descrito na seção 4. Fusível-los com 3 µ l de LUV ou chefe– (formada conforme descrito na secção 2) em 800 µ l de tampão D suplementado com 20 mM KCl e 1 mM MgCl2 por 5 min. Usando ações de alta concentração, adicione KCl e MOPS para concentração final de 100 mM e 50 mM para as membranas postfusion.Nota: Em caso de LUV pós-fusão, esta etapa irá impedir que seu inchaço devido ao deslocamento osmótico entre o externo (tampão A) e intravesicular (buffer D) concentração de sais. Opcionalmente, as membranas postfusion de Pelotas, conforme descrito em 7.2 para separar não tenha reagido SUV+e resuspenda o pellet em 800 µ l de tampão A. Prepare-se 200 µ l de uma luciferina-luciferase-ADP ADP contendo coquetel 400 µM, 50 luciferina µM e 2.5 µ g luciferase no tampão A Adicione o cocktail à mistura de postfusion de Step8.3. Adicionar 40 µM de oxidado coenzima Q1e disparar a energização das membranas postfusion de bo3-oxidase, adicionando 2 mM DTT. Espere por 1 min. Iniciar a síntese de ATP pela adição de fosfato de potássio de 5mm (KPeu, pH 7,4) a vesículas energizadas e detectar a produção de ATP com um luminómetro (Figura 7B). Execute a reação para ~ 3 min.Nota: Reação de síntese de ATP continua por 5-7 min até esgotamento de oxigênio consumido por bo3-oxidase e luciferase. Adicione um padrão de referência de ATP (0,5 nmol ATP) a mistura de reacção duas vezes. Medida de ATP produzido. Obter a quantidade real de ATP produzido na reação, dividindo-se o sinal de reação de síntese de ATP pelo sinal padrão de referência de ATP. Ajustar este valor para a quantidade total de F-1Fo utilizado na reação e finalmente expressar a taxa de síntese de ATP em µmol ATP / (mg F1Fó* min).

Representative Results

O uso de fusogenic complementares-carregado proteoliposomes para entrega rápido detergente livre de proteínas de membrana em membranas de BICAMADA alvo inclui três etapas (Figura 1): Aformação de fusogenic SUV de misturas de lipídios com alta conteúdo de lipídeos carregados; Estes SUV opcionalmente pode transportar uma carga intravesicular; B, conversão de fusogenic SUV em PL usando nossa reconstituição de proteína de membrana rápido; C, fusão de fusogenic PL com bilayers do alvo em um meio de baixo teor de sal, seguido pela adição de sal elevado para parar a reação de fusão. No caso de grandes vesículas (D), uma estratégia preferível é entregue a proteína de membrana na BICAMADA alvo aniônico, que fornece um melhor ambiente de lipídios para atividade de proteínas de membrana (mais discutidas no texto). O chefe protocolo de formação com método de emulsão invertida é realçado em detalhe na Figura 2. Nós preferimos usar hexadecano na mistura lipídica-óleo devido à sua relativamente alta temperatura de congelamento (18 ° C), que permite a fácil remoção do óleo solidificado depois chefe de granulação. A Figura 3 demonstra a fusão de vesículas, usando o método de cobalto-calceína-EDTA. Fusão é visto apenas quando vesículas carregadas complementares são usadas nos buffers de sal baixos, enquanto altas concentrações de sal (> 50 mM14) ou o uso de vesículas fusogenic não demonstram nenhuma fusão. Este protocolo rápido de reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic SUV é ilustrado na Figura 4A. Usando este protocolo, demonstramos rápido reconstituição de próton primário bomba bo3-oxidase e F1Fo ATP sintase em PL e avaliação da sua actividade específica nestas membranas. É importante mencionar que o rendimento da reconstituição de proteína não depende do custo de um lipídio usado15 e é cerca de 50-75,12, e que, após reconstituição em PL, a proteína pode ser armazenada pelo menos três dias, mesmo à temperatura ambiente sem óbvia perda de atividade da proteína. Este procedimento também fornece orientação unidirecional da ATP sintase, onde mais de 95% dos tem seu grupo hidrofílico F1 orientado para o exterior15,26. A Figura 5 demonstra que o próton bombeamento atividade de F1Fó (painel A) e bo3-oxidase (painel B) em lipídios catiônicos é reduzida e sensíveis à baixa força iônica, em comparação com o ambiente de lipídios aniônicos e neutra, mas Este efeito é atenuado em membranas de postfusion após a fusão PL+ com aniônico LUV–. A Figura 6 demonstra a entrega de F1Fo ATP sintase em membranas das vesículas grandes. No presente experimento, PL+ e 800 nm LUV– foram fundidos em 20 mM KCl por 5 min e o produto da reação foi peletizado para remover não fundida PL+, resuspended e analisada para bombear protões. Experimentos de controle não mostrou nenhum bombeamento de prótons quando LUV0 em vez de LUV– foram usados na reação de fusão (traço preto), ou vazio LUV– sozinho foram analisado (traço azul). Montagem rápida de uma funcionamento cadeia de transporte electrónico, nas membranas das vesículas grandes por meio de fusogenic PL é mostrada na Figura 7. Nós usamos F1Fo SUV+ e bo3 SUV+ para fusão com 800 nm LUV-e demonstrada a produção de ATP por essa cadeia em vesículas postfusion adicionando sequencialmente coenzima Q1 e TDT para energizar membranas e então a adição de fosfato para desencadear a síntese de ATP por F1Fó. Figura 1: concepção de entrega livre de detergente ultra rápida de proteínas de membrana em bilayers do lipid alvo através da fusão de vesículas unilamellar formada de lipídios carregados complementares. (A) formação de fusogenic catiônica e aniônica unilamellar pequenas vesículas (+de SUV, SUV–), opcionalmente, carregados com cargas intravesicular. (B) conversão de SUV de fusogenic em fusogenic proteoliposomes (PL) por reconstituição das proteínas de membrana. (C) detergente livre entrega de proteínas de membrana em membranas postfusion com estratégia preferível de fusogenic PL. (D) para a entrega das proteínas de membrana em membranas das vesículas grandes, ilustradas pela fusão entre 100 nm PL+ e 800 nm LUV–. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: chefe protocolo de formação com um método de emulsão invertida. (A) formação de uma monocamada de lipídios na fronteira entre a mistura de óleo-lipídios e água. (B) formação de uma emulsão (água em óleo) invertida. (C), chefe de formação, passando a emulsão através da fronteira da óleo-água por meio de centrifugação. (D) resfriamento do tubo abaixo < 18 ° C, para solidificar e remover o óleo. Imagem de microscopia fluorescente (E), A de um chefe que contém lipídios fluorescente (1% peso fração colesterol-Bodipy-FL12) em sua membrana (verde) e um fluoróforo polar (1mm sulforhodamina 101) no lúmen da vesícula (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: fusão de vesículas lipídicas estudou com o método de cobalto-calceína-EDTA. (A) diagrama esquemático do método, onde livre calceína é liberada de um complexo não-fluorescente cobalto-calceína pelo EDTA. (B) fusão de SUV em diferentes concentrações de KCl. (C) lançamento da calceína intravesicular pela adição de EDTA e Triton X-100 detergente para vesículas postfusion mostrado em B , conforme descrito no texto. A extensão de fusão (%) para rastreamento de vermelho é calculada dividindo-se o sinal de máxima fusão fundo-corrigido (1 – 2) pelo sinal máximo fundo-corrigido após o lançamento de calceína encapsulado (3-2) e multiplicando por 100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Ultrafast reconstituição de bo3-oxidase e F1Fó em fusogenic proteoliposomes e medidas de atividade da proteína em tais proteoliposomes. (A) esquema do protocolo de reconstituição. (B), coenzima Q1 oxidação conduzida bombeamento de prótons pelo bo3-oxidase no PL medido com ACMA têmpera (explicado no texto). (C) ATP orientada por hidrólise próton bombeamento por F1Fó em PL medido com ACMA têmpera (explicado no texto). (D) ATP hidrólise por F1Fó no PL medido com sistema de regeneração de ATP (explicado no texto) e sua estimulação pelo desacoplador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: influência do ambiente de lipídios e da força iônica na atividade de proteínas de membrana. Próton de bombeamento por F1Fo (A) e bo3-oxidase (B) em PL catiônica (traço vermelho), PL aniônico (traço azul), PL neutro (traço preto) e PL catiônica fundido com aniônico LUV (traço verde) em 20 e 100 mM KCl. controle rastreamento ( cinza) não mostra nenhuma mudança no próton bombeamento por F1Fó PL– após mistura com SUV–. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Entrega de F1Fo ATP sintase em membranas de 800 nm LUV– , através da fusão com o PL+. (A) diagrama esquemático do experimento: PL+ e 800 nm LUV– foram fundidos em 1mm MOPS (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl por 5 min, peletizado para remover não fundida PL e resuspended a mesma reserva. (B) prótons de bombeamento pelo postfusion LUV (traço vermelho). Experimentos de controle não mostrou nenhum ACMA têmpera quando PL0 foram misturadas com LUV– (traço preto), ou vazio LUV– sozinho foram analisado (traço azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: montagem sem detergente de 5 min de uma cadeia de transporte electrónico, nas membranas de 800 nm LUV– , através da fusão com o PL+. (A) diagrama esquemático da experiência: 100 nm F1Fo PL+ e 100 nm bo3-oxidase PL+ foram fundidos com LUV-, conforme descrito na Figura 6. Fusão foi interrompida pela adição de KCl e MOPS para 100 e 50 mM, respectivamente. As membranas foram misturadas com ADP-luciferina-luciferase cocktail e fortalecidas por adição de TDT e Q1, conforme descrito no texto. Produção de ATP foi iniciada pela adição de fosfato de 1 mM (Peu) e monitorado em tempo real com sistema de luciferase-luciferina, conforme descrito no texto. (B) ATP síntese por vesículas postfusion (traço vermelho). Experimentos de controle mostrados sem produção de ATP quando PL+ foram misturadas com LUV– em alta sal (cinza), ou PL0 foram misturadas com LUV– (preto). Taxa de síntese de ATP foi calculada conforme explicado no texto (etapas 8.8-8,9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A seguir alguns problemas precisam ser considerados para o sucesso desta abordagem experimental:

Escolha de carga lipídica para bilayers proteoliposomes e alvo: Lipídios catiônicos não são encontrados na natureza, enquanto lipídios aniônicos são abundantes em membranas biológicas, atingindo, por exemplo, ~ 25, 35 e 20% na membrana interna da e. coli, a membrana plasmática de levedura S. cerevisiaee membranas mitocondriais internas de muitas espécies, respectivamente^27,28,29. Seria razoável esperar que a funcionalidade das proteínas de membrana em PL⁺ pode ser afectada pela força de uma carga positiva da bicamada, que por sua vez depende de um conteúdo relativo de lipídios catiônicos na BICAMADA e externo iônico força. Portanto, é importante abordar experimentalmente em que medida a funcionalidade das proteínas de membrana de interesse dependeria a carga do ambiente lipídios catiônicos. Aqui, nós mostramos que ambos F₁F_o ATP sintase e bo₃-oxidase são sensíveis ao ambiente de lipídios catiônicos, mas conseguimos modular e reverter esse efeito primeiro colocando as proteínas em PL⁺ e entregá-los em aniônicos, aceitando bilayers e em seguida, aumento da força iônica do meio de reação após a fusão está acabado.

Escolha de um determinado lipídios catiônicos: A maioria dos lipídios catiônicos comercialmente disponíveis são de natureza não-triacilglicerol; Portanto um lipido candidato potencial deve ser testado para compatibilidade com proteínas de membrana de interesse. Encontramos anteriormente¹⁵ que a ATP sintase utilizado neste estudo mostrou que seu melhor desempenho no PL⁺ formada de etil-PC, que tem a maior semelhança estrutural para os lipídios de triacilglicerol natural, enquanto em DOTAP (não-triacilglicerol lipídica) PL⁺ esta proteína foi menos ativa.

Ensaios de fusão de vesículas: Fusão de vesículas verdadeira (quando o conteúdo líquido intravesicular mistura) precisa ser diferenciada de Estados intermediários de hemi-fusão, quando vesículas aderem-se uns aos outros sem misturar seu conteúdo aquoso, mas facilmente misturam o conteúdo do seu externo ou ambos os lipídios folhetos de³⁰. No caso de misturas de lipídios suboptimal ou certas condições, vesículas demonstraram também pronunciado vazamento conteúdo líquido durante fusão³¹. Concentrações mínimas de lipídeos carregadas em misturas de fusogenic permitindo a verdadeira fusão precisam ser encontrado experimentalmente para cada espécie de lipídios, mas em geral, encontra-se que as membranas com menos de 10% cobrado lipídios são processados não-fusogenic ³².

Enquanto formando fusogenic SUV na presença de íons de multi-valente, é importante não misturar componentes de carga oposta, pois isso pode causar aglutinação imediata e agregação de lipídios por esses íons. Por exemplo, enquanto se prepara SUV para o método de cobalto-calceína-EDTA, é importante evitar a mistura de uma mistura de lipídios catiônicos com EDTA para evitar o entupimento do filtro de policarbonato por componentes agrupados.

Também é importante mencionar que o método de cobalto-calceína-EDTA, sendo muito sensível e conveniente para monitoramento em tempo real fusão, pode ainda subestimam o grau de fusão devido 1) Self têmpera da fluorescência de calceína livre dentro vesículas postfusion, que é esperado para chegar a 1 mM, enquanto o limite de resfriamento self é relatado para ser em torno de 20 µM,³³e 2) ligados a superfície cobalto-calceína, que permanece ligado ao SUV⁺ mesmo após a passagem com a resina de gel filtração e cores vesículas para uma cor laranja brilhante, enquanto o SUV⁰ tem uma cor laranja pálida. Observe também que o lançamento do limite cobalto-calceína sobre adição de detergente Triton X-100 na presença de EDTA gera sinais muito mais fortes para SUV⁺ (Figura 3, traço vermelho) que SUV⁰ (traço cinzento).

Perspectivas: esperamos que as abordagens rápidas descritas aqui grandemente podem facilitar e acelerar a montagem do complexo de membranas para as necessidades dos emergentes aplicações de biologia sintética. Nosso protocolo de reconstituição de proteína de membrana leva apenas meia hora para reconstituição das proteínas de membrana grande frágil conhecidos para ser sensível às técnicas demoradas reconstituição baseada em diálise, enquanto esta abordagem fusogenic leva apenas 5-10 min para entregar essas proteínas em bilayers do lipid grande. Aqui, demonstramos as vantagens dessas abordagens manipulando Escherichia coli F₁F_o ATP sintase, que é um exemplo de uma proteína frágil. É feito de 23 subunidades e é conhecido por facilmente perder sua integridade se expostos a condições de qualidade inferior (por exemplo, calor) durante/Após solubilização, mas sendo usado nesses procedimentos, a proteína demonstra reproducibly alta atividade no bombeamento de prótons.

Materials

DOPC neutral lipid	Avanti Lipids	850375
POPA anionic lipid	Avanti Lipids	840857
E-PC cationic lipid	Avanti Lipids	890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12	Thermofisher	C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine	Sigma	G5050
Ficoll 400, Type 400-DL	Sigma	F8016
ACMA	Sigma	A5806
Nigericin	Sigma	N7143
ATP	Sigma	A26209
Q1	Sigma	C7956
DTT	Sigma	D0632
PEP	Sigma	860077
NADH	Sigma	N8129
PK	Sigma	P9136-1KU
LDH	Sigma	L1254-1KU
Luciferin	Sigma	L6882
Luciferase	Sigma/Roche	10411523001
Calcein	Insight Biotechnology	sc-202090
CoCl2	Sigma	C8661
EDTA	Sigma	E6758
Sulforhodamine 101	Sigma	S7635
Extrusion system	Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L	Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm	Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes	WHA800309, WHA800284	100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Buffers used in the paper	Composition
Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer A			100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B			20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C			100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D			1 mM MOPS pH 7.4 Various concentrations of KCl