Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co
Summary
Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.
Abstract
Die Fähigkeit, Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Genesis während der Embryonalentwicklung wurde begrenzt durch die Seltenheit der HSC-Vorstufen in der frühe Embryo und das Fehlen von Assays, die funktionell das langfristige multilineage Engraftment Potenzial identifizieren einzelne vermeintliche HSC-Vorläufer. Hier beschreiben wir die Methodik, die die Isolierung und Charakterisierung von funktionell validierten HSC-Vorläufer der Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Erstens verwenden wir Index Sortierung den präzise phänotypischen Parameter jeder einzeln sortierten Zelle Katalog mit einer Kombination aus phänotypische Markierungen für HSC-Vorstufen mit zusätzlichen Markern für die experimentelle Analyse zu bereichern. Zweitens ist jeder Index sortiert Zelle Co kultiviert mit vaskulären Nische Stroma aus der Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region, die die Reifung der nicht Einpflanzen HSC Vorläufer des funktionalen HSC mit multilineage, langfristige Engraftment Potenzial in unterstützt Transplantation-Assays. Diese Methodik ermöglicht die Korrelation der phänotypischen Eigenschaften von klonalen Hemogenic Vorstufen mit ihrem funktionalen Engraftment oder andere Eigenschaften wie transkriptionellen Profil, was ein Mittel für die detaillierte Analyse des HSC Vorläufer Entwicklung auf der Ebene der einzelnen Zelle.
Introduction
Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung1. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang2. Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditionierten Erwachsenen Empfänger werden nicht erkannt, erst nach embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der murinen Embryo bei sehr niedrigen Frequenz3 . Während ihrer Entwicklung müssen Vorläufer des HSC (Pre-HSC) aus Hemogenic Endothel unterziehen Reifung vor dem Immobilienerwerb von Erwachsenen HSC die ermöglichen effiziente Engraftment Transplantation Assays4,5 , 6. verdeckt das Studium der seltenen HSC Herkunft, eine Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit erythroiden, myeloischen und lymphatischen Potenzial werden schon vor der Entstehung des HSC von Pre-HSC7,8erkannt. Pre-HSC von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu unterscheiden erfordert daher Methoden klonal Zellen zu isolieren und Ihnen mit den Signalen ausreichend für ihre Reifung, HSC, um ihre Engraftment Eigenschaften in Transplantation Assays zu erkennen.
Eine Reihe von Ansätzen sind beschrieben worden, die für den Nachweis von Pre-HSC von ex-Vivo oder in Vivo Reifung, HSC ermöglichen. Ex-Vivo -Methoden sind angewiesen, auf die Kultur der embryonalen Gewebe, wie z. B. der AGM-Region, wo die ersten HSC in Entwicklung9erkannt werden. Aufbauend auf diese Methoden, Protokolle, die die Dissoziation zu integrieren haben sortieren und Re-Aggregation von AGM Geweben die Charakterisierung der sortierten Populationen mit HSC Vorläufer bei der Entwicklung von E9.5 zu E11.5 in der Para-aortalen zulässig Splanchnopleura (P-Sp) / AGM Regionen4,5,10; Allerdings sind diese Ansätze nicht zugänglich Hochdurchsatz-Analyse der Vorläufer der Ebene der Einzelzelle für klonale Analyse erforderlich. In ähnlicher Weise in Vivo Reifung durch Transplantation in Neugeborene Mäuse, wo der Mikroumgebung vermutlich besser geeignet für die Unterstützung der früheren Phasen des HSC Vorstufen, ermöglichten auch Studien der sortierten Bevölkerungen aus dem Dottersack und AGM / P-Sp (P-Sp ist die Vorläufer-Region zur Hauptversammlung) mit Merkmalen der Pre-HSC, aber diese Methoden auch scheitern, eine robuste Plattform für einzelne Zelle Analyse11,12.
Studien von Rafii Et Al. haben gezeigt, dass dieser Akt aktiviert Endothelzellen (EG) Stroma eine Nische Substrat für die Unterstützung von Erwachsenen HSC Selbsterneuerung in-vitro-13,14,15bieten kann. Wir entschlossen vor kurzem, dass Akt aktiviert EG abgeleitet aus der AGM-Region (AGM-EC) eine geeignete in-vitro- Nische für die Reifung der Hemogenic Vorläufer bietet, so früh wie E9 in Entwicklung, für die Erwachsenen Einpflanzen HSC sowie die anschließende isoliert Selbsterneuerung der generierten HSC16. Angesichts der Tatsache, dass dieses System eine einfache 2-dimensionale kokultur beschäftigt, ist es leicht anpassbar für klonale Potenzialanalyse der HSC einzeln isolierten Hemogenic Grundstoffe.
Vor kurzem haben wir ein Konzept für die HSC-Potenzial der klonalen Hemogenic Vorstufen assay durch die Kombination von Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen aus murinen Embryonen mit AGM-EG Kokulturen und anschließenden Funktionsanalyse in der Transplantation berichtet. 17Tests. Index zu sortieren ist eine Art der Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), die Datensätze (Indizes) alle phänotypischen Parameter (d.h., forward Scatter (FSC-A), Side Scatter (SSC-A), Fluoreszenz Parameter) jeder einzeln sortierten Zelle so, dass diese Funktionen können rückwirkend mit anschließenden Funktionsanalyse nach Sortierung korreliert werden. FACS-Software zeichnet sowohl phänotypische Informationen für jede Zelle und die Position/gut von den 96-Well-Platte, in die sie gestellt wurde. Diese Technik wurde bisher elegant zur erkennen Heterogenität in Erwachsenen HSC, phänotypische Parameter, die weiter für die langfristige anwachsen Teilmenge der HSC zu bereichern, und phänotypischen Parameter des HSC mit transkriptionelle korrelieren Eigenschaften auf die einzelne Zelle Ebene18,19. Hier bieten wir detaillierte Methode dieses Ansatzes, die Identifikation der einzigartigen phänotypischen Parameter und Abstammung Beiträge von Pre-HSC in frühen Phasen der Embryonalentwicklung ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie der HSC Genesis während der embryonalen Entwicklung erfordert Mittel, HSC Potenzial in Hemogenic Vorläufer noch fehlt die Kompetenz zur langfristigen multilineage hämatopoetischen Rekonstitution bei transplantierten Erwachsenen Empfängern zur Verfügung stellen zu erkennen. In diesem Protokoll präsentieren wir einen klonalen Assay der embryonalen Hemogenic Vorläufer von Stromazellen kokultur auf vaskuläre Nische ECs aus der Jahreshauptversammlung, die die Reifung der Vorläufer des HSC unterstützt, mit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Andrew Berger, Stacey Dozono und Brian Raden im Fred Hutchinson Flow Cytometry Kern für Hilfe mit FACS. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit NHLBI UO1 Grant #HL100395, unterstützt zusätzliche kollaborative Grant #HL099997 und NIDDK gewähren #RC2DK114777. Brandon Hadland wird von Alex es Lemonade Stand Foundation und Hyundai Hope auf Rädern-Stiftung unterstützt.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referencias
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