ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת
Summary
כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.
Abstract
היכולת ללמוד תאי גזע hematopoietic (HSC) בראשית במהלך התפתחות עובריים יש היה מוגבל על-ידי בנגישות של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי ב העובר מוקדם והיעדר מבחני שמזהים את הפוטנציאל multilineage engraftment לטווח ארוך של פונקציונלית בודדים בשם HSC סימנים מקדימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המאפשרת את בידוד ואפיון של מבשרי HSC מאומתים באופן פונקציונלי ברמת תא בודד. ראשית, אנו מנצלים אינדקס מיון לקטלוג הפרמטר פנוטיפי מדויק של כל תא בנפרד ממוינים, באמצעות שילוב של סמנים פנוטיפי להעשיר עבור מועדון הכדורגל מונפלייה סימנים מקדימים עם סמנים נוספים עבור ניתוח ניסיוני. שנית, כל תא ממוין אינדקס הוא תרבותי משותף עם נישה וסקולרית משתית מאזור (AGM) אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros, אשר תומכת ההבשלה של הלא-engrafting מועדון הכדורגל מונפלייה המבשרות על HSC פונקציונלי עם פוטנציאל multilineage, לטווח ארוך engraftment מבחני השתלת. מתודולוגיה זו מאפשרת המתאם המאפיינים פנוטיפי של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים עם הפוטנציאל שלהם engraftment תפקודית או מאפיינים אחרים כגון פרופיל תעתיק, מתן אמצעים לניתוח מפורט של מועדון הכדורגל מונפלייה קודמן פיתוח ברמה תא בודד.
Introduction
המשובטים מחקרים גילו הטרוגניות במאפיינים engraftment לטווח ארוך של HSCs למבוגרים, לספק תובנה חדשה HSC יחוברו ושינויים בהתנהגות HSC במהלך ההזדקנות1. עם זאת, מחקרים דומים של HSCs עובריים ו מבשרי שלהם כבר יותר מאתגר. במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, HSCs נובעים אוכלוסיה של סימנים מקדימים המכונה hemogenic אנדותל בתהליך ארעי התייחס כאל אנדותל המעבר hematopoietic2. הראשונה מועדון הכדורגל מונפלייה, שהוגדרו על-ידי היכולת שלהם לספק engraftment multilineage חזקות, לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך נמענים למבוגרים ממוזגים, לא מזוהים עד לאחר יום עובריים 10.5 (E10.5) בהעובר מאתר, תדירות נמוכה מאוד3 . במהלך התפתחותם, המבשרות על מועדון הכדורגל מונפלייה (pre-HSC) הנובעות hemogenic אנדותל חייב לעבור התבגרות לפני רכישת מאפייני HSC למבוגרים המאפשרים engraftment יעיל השתלת מבחני4,5 , 6. פגיעה ביעילות המחקר ממוצא HSC נדירים, שפע של אבות hematopoietic עם erythroid, פוטנציאל מיאלואידית, ו הלימפה כבר זוהו לפני ייסודה של מועדון הכדורגל מונפלייה טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה7,8. לפיכך, שיסייעו לך לייחד טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה אבות hematopoietic אחרים דורש שיטות clonally בידוד תאי, לספק להם האותות מספיק עבור ההבשלה שלהם כדי HSC, לזהות את המאפיינים engraftment שלהם מבחני השתלת.
מספר גישות תוארו המאפשרות איתור קדם-מועדון הכדורגל מונפלייה על ידי התבגרות או ex-vivo או vivo כדי HSC. שיטות שמחוץ היו תלויים תרבות של רקמות עובריים, כגון האזור AGM, איפה מועדון הכדורגל מונפלייה הראשון מזוהים פיתוח9. על שיטות אלה, פרוטוקולים אשר משלבות את הדיסוציאציה, מיון של צבירת מחדש של רקמות AGM התירו אפיון אוכלוסיות ממוינים המכיל HSC מבשרי במהלך הפיתוח מ E9.5 ל E11.5 ב פארא-ותיני splanchnopleura (P-Sp) / AGM אזורים4,5,10; עם זאת, גישות אלה אינם לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של סימנים מקדימים ברמת תא בודד נדרש לניתוח המשובטים. באופן דומה, אין ויוו ההבשלה על ידי השתלת לתוך עכברים היילוד, איפה microenvironment המשוער יהיה מתאים יותר התמיכה של שלבים מוקדמים של מועדון הכדורגל מונפלייה מבשרי, איפשר גם מחקרים על אוכלוסיות ממוינים מן החלמון AGM / P-Sp (P-Sp הוא האזור קודמן כדי ומזכיר האסיפה) עם מאפיינים של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה, אבל השיטות האלה גם להיכשל כדי לספק פלטפורמה חזקה ליחיד תא ניתוח11,12.
לימודי Rafii. et al. הפגינו שאת משתית תא אנדותל לפעיל על-Akt (EC) מספקים מצע נישה עבור התמיכה של מבוגרים HSC התחדשות עצמית במבחנה13,14,15. אנחנו נקבע לאחרונה כי מופעל Akt EC נגזר מן האזור AGM (AGM-EC) מספק משרה מתאימה במבחנה ההבשלה של מבשרי hemogenic, מבודד מוקדם ככל E9 בפיתוח, כדי engrafting למבוגרים מועדון הכדורגל מונפלייה, כמו גם עוקבות התחדשות עצמית של מועדון הכדורגל מונפלייה שנוצר16. נתון כי מערכת זו מעסיקה תרבות משותפת 2-ממדי פשוטה, זה בקלות להתאמה לניתוח המשובטים של הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic מבודדים בנפרד.
לאחרונה דיווחנו גישה assay הפוטנציאל HSC של סימנים מקדימים hemogenic המשובטים על-ידי שילוב מדד מיון של סימנים מקדימים hemogenic בודדים מעוברים מאתר עם תרבות משותפת AGM-EC, אנליזה פונקציונלית הבאים בהשתלת מבחני17. אינדקס מיון הוא תא מצב של לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) את הרשומות (אינדקסים) כל הפרמטרים פנוטיפי (קרי, פיזור קדמי (FSC-A), לצד פיזור (האס-A), קרינה פלואורסצנטית פרמטרים) של כל תא בנפרד ממוינים כזה אלו תכונות ישויך retrospectively כדי שלאחר מכן אנליזה פונקציונלית בעקבות מיון. תוכנה FACS רשומות הן מידע פנוטיפי עבור כל תא, הבאר/המיקום של צלחת 96-ובכן בו היא מוצבת. טכניקה זו בעבר שימש באלגנטיות כדי לזהות הטרוגניות במועדון הכדורגל מונפלייה למבוגרים, לקבוע פרמטרים פנוטיפי נוספת להעשיר עבור המשנה engrafting לטווח ארוך של מועדון הכדורגל מונפלייה, לתאם את הפרמטרים פנוטיפי של מועדון הכדורגל מונפלייה עם תעתיק מאפיינים-הסינגל תא רמה18,19. כאן, אנו מספקים נתונים היסטוריים מתודולוגיה של גישה זו, אשר מאפשרת זיהוי של פרמטרים ייחודיים פנוטיפי ו שושלת היוחסין תרומות של טרום-מועדון הכדורגל מונפלייה בשלבים המוקדמים של התפתחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר של מועדון הכדורגל מונפלייה בראשית במהלך התפתחות עובריים מחייבת אמצעי לגילוי HSC פוטנציאל מבשרי hemogenic עדיין חסר את היכולת לספק הכינון hematopoietic multilineage לטווח ארוך ב המושתלים נמענים למבוגרים. פרוטוקול זה, אנו מציגים וזמינותו המשובטים של סימנים מקדימים hemogenic עובריים מאת סטרומה תרבות משותפ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אנדרו ברגר, סטייסי Dozono, בריאן Raden פרד האצ’ינסון Flow Cytometry הליבה לקבלת סיוע עם FACS. עבודה זו נתמכה על ידי המענק נבחרת מוסדות של בריאות NHLBI UO1 #HL100395, נלווים-שיתופי גרנט #HL099997, NIDDK הענק #RC2DK114777. ברנדון Hadland נתמך על ידי אלכס של לימונדה לעמוד קרן ותקווה יונדאי על בסיס גלגלים.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referencias
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
