マウス脂肪組織の採取と RNA 解析のための処理
Summary
本稿の目的は、マウスから異なる白色脂肪組織を収集、脂肪質のサンプルを処理および RNA を抽出する手順を提示することです。
Abstract
他の組織と比較して、白色脂肪組織は、脂質がほとんど含まれているのでは、下流用リアルタイム PCR および西部のしみなどかなり少ない RNA および蛋白質内容です。これらの脂質を避けるために余分な手順が必要と脂肪組織サンプルからの RNA の隔離も挑戦します。これらのサンプルを処理し、RNA の隔離を実行するマウスから 3 つの異なる解剖学的白色脂肪組織を集めるための手順を紹介します。さらにリアルタイム PCR を用いた cDNA や遺伝子発現実験の合成について述べる。ここに記載されているプロトコルには、動物の毛や組織コレクション中に別の脂肪パッド間の交差汚染と同様、脂肪パッド上の血からの汚染の削減ができます。また、抽出した RNA の十分な量と質を確保するため最適化されています。このプロトコル脂肪組織サンプル、リアルタイム PCR など日常の実験に必要な任意のマウスのモデルに広く応用することができますが、主な脂肪細胞培養からの分離のためのものではありません。
Introduction
肥満はタイプ 2 の糖尿病1などの合併症につながることが世界的に流行です。食餌誘導性肥満と遺伝子組み換え動物モデルは、肥満とその関連する合併症で研究に頻繁に使用されます。通常、白色脂肪組織は余分なエネルギーのための収納スペースとして知られている、脂質の構成は主にエネルギーに変える褐色脂肪組織熱2,3間。脂肪組織は動的と拡大し、食品の摂取量、身体活動など多くの要因によって縮小します。したがって、これらの変更に貢献の要因を決定する適切な脂肪組織の採取と処理が必要な4 です。
白色脂肪組織の間で、皮下脂肪および内臓脂肪質のターミナルを解剖学的局在など異なるプロパティを持つ機能2、5それを一般に認められます。その結果、矛盾する結果や大規模な変動を避けるためには、注意を脂肪パッドを収集するときこれらの異なる脂肪質のターミナル間の交差汚染を避けるために取られる必要があります。
また、白いマウス脂肪組織からタンパク質や RNA を隔離するときの 3 つの主要な課題があります。まず、肥満マウスの脂肪パッドを収集別の白い脂肪質のターミナルを隔てる境界線は常に明確で心6腎臓など他の臓器とは対照的ではない、簡単な作業ではありません。第二に、RNA または蛋白質の分離の間に、脂肪の高い脂質含量のため、脂質の層の上に浮かぶし、サンプルに直接アクセスできなくなります。第三に、褐色脂肪組織や他の組織ではなく白色脂肪組織は RNA および蛋白質含量がかなり低いとこれは若いマウスを使用する場合の大きな懸念材料は、投与されたマウスは通常の (N) 食事あり、マウスが期待される低脂肪塊 (すなわちKO モデル、薬物による治療は運動トレーニングなど)。7,8。
したがって、脂肪組織からの RNA を隔離する適切な方法を選択することは重要です。フェノール/クロロホルム抽出する別の方法は、商業キットです。彼らは通常列9の RNA の浄化に続いて、初期のフェノール抽出手順に基づいています。しかし、これらのキット通常より高価なと RNA の品質は、変数かもしれない低い収率のサンプルを与えるより時間がかかる。ただし、フェノールのソリューション/クロロホルム抽出ここで説明する最も大きな利点の 1 つは単一のサンプル10からの蛋白質、DNA、RNA を分離する可能性です。マウス脂肪パッドは、通常小さい (無駄のないマウス モデル) を中心に少量の RNA および蛋白質を与えるので、これらのプロトコルは、小さなサンプル 1 つ得ることができるデータを最大化します。
本稿の目的は、白い 3 つのマウス脂肪組織拠点と同様の RNA の隔離の質と量から適切なサンプル収集を確保する方法を詳しく説明するようです。このプロトコルに従うことによって得られる RNA は、リアルタイム PCR の試金を実行する使用できます。このプロトコルは培養された主な脂肪細胞からの RNA の隔離のためのものではありません。
Protocol
Representative Results
Discussion
次 HF 食事供給、肥満マウスは体と白色脂肪組織重量 N 飼料飼育マウスと比較して増加するいると見つけられました。フェノール溶液を使用して抽出した RNA 純度の良い試料が得られました。レプチンは主に脂肪組織によって生成、アデポカイン、脂肪質量16と正の相関が知られています。予想通り、自分の脂肪の塊な肥満マウスにおけるレプチン mRNA の発現が増加しました?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、糖尿病カナダによって支えられました。
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Referencias
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