Оптимизированный Эванс синий протокол для оценки сосудистые утечки в мышь
Summary
В этой статье экономичным, оптимизированный и простой протокол описан, которая использует метод Эванс синий краситель для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей, которые могут быть адаптированы для использования в других штаммов, видов и других органов или тканей.
Abstract
Сосудистые утечки или плазмы кровоподтек, имеет ряд причин и может быть серьезным последствием или симптом воспалительной реакции. Это исследование в конечном итоге может привести к новые знания о причинах или новые способы препятствовать или лечения плазмы кровоподтек. Важно, что исследователи имеют правильные инструменты, включая передовые методы, для изучения плазмы кровоподтек. В этой статье мы описываем протокол, с помощью метода синий краситель Эванс, для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей. Этот протокол намеренно прост, чтобы как большой степени, как возможно, но обеспечивает высокое качество данных. Эванс синий краситель был выбран главным образом потому, что это легко для среднего лаборатории для использования. Мы использовали этот протокол для предоставления доказательств и поддержку для гипотезы, что фермент neprilysin может защитить сосудистую против плазмы кровоподтек. Однако этот протокол может экспериментально используются и легко адаптировать для использования в других штаммов мышей или других видов, во многих различных органов или тканей, для исследований, которые могут включать другие факторы, которые важны в понимании, профилактики или лечения плазмы кровоподтек. Этот протокол был широко оптимизирован и изменение существующих протоколов, и сочетает в себе надежность, простота использования, экономики и общей доступности материалов и оборудования, что делает этот протокол Улучшенный для среднего лаборатории для использования в количественная оценка плазмы кровоподтек от органов.
Introduction
Сосудистые утечки в органах относится к кровоподтек, или утечки плазмы крови через пробелы, в эндотелия пост капиллярного венул в органах. Этот плазмы кровоподтек или повышение сосудистой проницаемости, которые могут возникнуть от некоторого типа воспалительной реакции, могут иметь серьезные последствия. Таким образом, важно, что это явление, ее причины, модуляторы и последствия, изучал и понимать, и аналогично, что следователи имеют хорошие инструменты и протоколы с которой для их изучения. Эндотелиальные пробелы могут быть произведены через ряд стимулов, но обычно производятся действия пептида нейротрансмиттеров и/или тахикининов на endothelia. Одним из основных естественных посредников этого процесса, что приводит к увеличению плазмы кровоподтек, является нейропептида tachykinin undecapeptide, вещество P1.
Методы расследования и измерения проницаемости сосудов или плазмы кровоподтек, которые используют свойство альбумин привязки Эванс синий краситель, были разработаны и обычно известны за их точность, простота, экономики, безопасности и возможность определение плазмы кровоподтек из нескольких тканей сразу, если необходимо2,3,4,5,6,,78,9 . Этот протокол Эванс синий для оценки плазмы кровоподтек в органах FVBN мышей использует все эти, но добавляет некоторые важные изменения, которые делают его вообще полезным и адаптированы для будущих исследований, связанных с средняя лаборатория, которая проводит или будет проводят важные исследования факторов, связанных с плазмы кровоподтек или сосудистой проницаемости. В этом протоколе вещество P вводится для мышей 1 нмоль/кг, который дополняет кровоподтек плазмы в 1,5 раза. Это повышает чувствительность протокола, что приводит к более легко наблюдаемых и получить результаты. Другие факторы, которые влияют проницаемости, такие, как различные другие пептиды, химических веществ или некоторые виды токсичных травмы, могут быть использованы или изучены другими лабораториями, как хотелось. Яремной инъекции используются в настоящем Протоколе системно, ввести синий Эванс и вещества P, который требует терминала хирургии. Однако яремной инъекции5,7,10, даже после рассмотрения необходимости терминал хирургические методы, легче освоить и привести к производству более последовательные результаты, чем другие венозная инъекции, включая хвост вен инъекции4,9. Хотя это может быть возможным для Эванс синий доставляться иньекциями ретро орбиталь венозного синуса, нет ссылок в литературе были найдены, что использовать этот способ доставки Эванс синего. Однако что касается инъекции Вену хвост, высокая степень знания и практики можно воспроизвести освоить эту технику значительно ограничивает его использование для успешного Эванс синий инъекции. В отличие от альтернативных яремной инъекционный метод как описано в наших протокол предлагает технически доступная решение. Решающее значение процедуры для перфузии мыши вен, выполняется только после того, как жертву сине увлажненную мыши Эванс, удаляет избыток Эванс синий краситель и был стандартизирован в настоящем Протоколе. Ранее описанных методов перфузии были тщательно рассмотрены и изменены для получения настоящей процедуры. Другие изменения, описанные здесь все оптимизированные, простой и недорогой.
Существуют некоторые важные ограничения метода синий краситель Эванс. Например низкая чувствительность, иногда связанные с этим методом может предотвратить некоторые грубых патологических и гистологической дообследование тканей от Эванс сине вводят животных. Однако эти и другие ограничения привели к развитию альтернативных методов и моделей, которые, тем не менее, по-прежнему использовать синий Эванс. Измерение Эванс голубой флуоресценцией (а не visual диапазона) спектроскопия может увеличить чувствительность метода. Кроме того микроскопии флуоресцирования Эванс сине окрашенных тканей была разработана для наблюдения сосудистые утечки в более различных местах11. Кроме того всего тела imaging и сканирование живое животное ранее вводили с Эванс, синий12 позволяет для расследования Эванс синий концентрации на постоянной основе, а не на одно конкретное время выбран пункт эксперимента. Однако этот метод требует наличия соответствующих изображений объектов и может быть очень дорогим. Изменения с участием Эванс синий и выступал в vitro тип модели, такие как в ячейку культуры или куриных chorioallantoic модель13 (CAM) также были описаны. Эти модели контролируются флуоресценции и прижизненной14 микроскопии и позволить количественная оценка проницаемости сосудистых изменений с течением времени, но может поднять вопросы, касающиеся точного моделирования условий в естественных условиях и могут также быть дорого.
Там были другие методы, разработанные для определения и количественной оценки сосудистые утечки или проницаемость, не предполагающих администрации Эванс синий. Эти методы могут использовать соответствующие флуоресцентные молекулы (например, альбумин или флуоресцеин), или гетерогенны помечены или иным образом тегами молекулы, жить животных (или в ячейку культуры или chorioallantoic (CAM) модели13, следуют неинвазивных Обработка изображений (ПЭТ, МРТ, прижизненной микроскопии, сканирование всего тела) или инвазивных изображений (Люминесцентная микроскопия)3,12,15. Хотя эти методы могут предложить ряд преимуществ над другими Эванс синий методы, они также имеют недостатки, которые могут включать в себя их значительные сложности, необходимого опыта, ресурсов и высокие денежные расходы.
Neprilysin16 (пептидаза фермента НЭПа, также известный как CD10, MME или Enkephalinase) было предложено принять участие в подавлении плазмы кровоподтек, по крайней мере частично, через ферментативный метаболизм и инактивации эндогенного вещество п. Таким образом в тканях, в которых происходит клеток поверхности пептидаза НЭПа, возможно ослабление воздействия вещества P, предположительно, пептидаза активность нэпа
Первоначально мы проверили для вещества P индуцированной плазмы кровоподтек, используя этот измененный Протокол Эванс синий, с FVBN дикого типа (WT) и НЭП нокаут (KO) мышах. НЭП причастности вещество P Расширенная плазмы кровоподтек подозревался в этих первоначальных исследований, мы и описать эти дальнейших экспериментов с участием нэпа роль в плазмы кровоподтек. Однако в центре внимания этой рукописи не нэпа или его роль в плазмы кровоподтек, но скорее плазмы кровоподтек эксперименты сами. Результаты НЭПа, представитель рода результаты, которые могут быть получены путем использования этого измененного Протокола. Эванс синий метод измерения плазмы кровоподтек оптимизированы и изменены, как описано в деталях ниже для FVBN мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как указывалось выше, исследование плазмы кровоподтек в конечном итоге может привести к новые знания о причинах или новые способы препятствовать или лечения плазмы кровоподтек. Успешное использование плазмы кровоподтек протокола (см. выше), с помощью Эванс синий краситель, была продем…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Энди Почобут и доктор Йори Лещинский за их ценную помощь и изменения в этой рукописи. При поддержке грантов, полученных от национальных сердца, легких и крови института (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 и RO3 HL095439) и Департамент по делам ветеранов (заслуги обзор).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referencias
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
