Burada bir iletişim kuralı protein microcrystals kontrollü üretim için mevcut. Süreç kontrollü kristalizasyon parametreleri çeşitli manipülasyon sağlayan otomatik bir aygıt kullanır. Protein kristalizasyon taşınan-izleme ve kristalizasyon damlacık parçacıklar RADIUS dağılımı soruşturma sırasında kontrollü ve otomatik eklenmesi kristalizasyon çözümleri tarafından out.
Özellikle protein kristalizasyon deneyler kesin çekirdekleşme ve istenilen boyutlarda doğru kristal gelişmesi protein kristalleri manevra amacı ile izlemek için geliştirilen patentli tekniği1 otomatik kristalizasyon cihazdır. Damlacık tüm görsel değişiklikleri online böylece tam bir etkinleştirme bir CCD kamera için birleştiğinde mikroskop yardımı ile izlenir iken örnek soruşturma in situ dinamik ışık saçılma (DL) ile kontrollü kristalizasyon dayanır protein damlacık soruşturma kristalizasyon her aşaması sırasında. Situ DLS ölçümleri boyunca tüm deneme kullanımı yeni bir faz-kristal çekirdek oluşumu geçiş son derece aşırıdoygun protein çözüm kesin bir kimlik sağlar. Protein çekirdekleşme sahne tanımlayarak, kristalizasyon büyük protein kristalleri protein microcrystals üretim için optimize edilebilir. Deneysel protokol bir etkileşimli kristalizasyon precipitant ek olarak, su buharlaşma inducing yüksek supersaturation için gibi hassas otomatik adımları dayalı yaklaşım ve yavaşlama için numune dilüsyonu homojen çekirdekleşme indüklenen gösterir veya Faz geçişleri ters.
Son birkaç yıl içinde protein mikro – ve nanocrystals protein-kristalografisi topluluk dikkat özellikle ile sürekli gelişim seri Femtosecond kristalografisi (SFX) ele geçirdi. Roman X-ray parlak nedeniyle radyasyon kaynakları ve şu ana kadar elde edilen başarılı sonuçlarına göre protein mikro – üretim ve nanocrystals yüksek alaka, kristal böyle süspansiyonlar hazırlanması üzerinde yüksek bir talep poz haline gelmiştir 2 , 3. serbest elektron lazerler (XFELs), veri toplama ve deneysel beamtime sınırlı kullanılabilirlik için gerekli küçük kristal boyutu-aralığı nedeniyle örnek karakterizasyonu veri toplama önce esastır. Protein mikro – veya nanocrystal süspansiyonlar karakterize etmek için en sık kullanılan teknikler şimdi elektron mikroskobu ve x-ışını toz difraksiyon kadar vardır.
Şimdiye kadar birkaç yaklaşım ortak kristalizasyon yöntemlerinden protein kristalleri ile boyut küçük mikrometre aralığı toplu miktarlarda üretmek amacı ile adapte. Yüksek konsantrasyonlu protein ve precipitant çözümleri, böylece örnek çözümü nanocrystallization tercih4nerede olabileceğini son derece aşırıdoygun bir aşamaya zorlama hızlı karıştırma için kullanılan toplu iş yöntemidir. Diğer yöntemleri için veri koleksiyon5kullanılmak üzere nanocrystalline süspansiyonlar olarak hizmet verebilir bir kristal Bulamaç oluşturmak için büyük protein kristalleri kırma içerir. Ancak, sonuçlar bazen bozulan kristalleri düşük iç sınıf gibi azalmış kırınım kalitesinde neden olabilir. Ücretsiz arabirimi difüzyon dayalı Nanocrystallization da kullanılabilir, protein çözüm son derece yoğun precipitant çözüm3küçük miktarlarda eklendiği yerine kullanılabilir. Ancak, tüm teknikleri arasında en etkili yöntemleri toplu kristalizasyon ve daha yenilikçi manipülatif teknikleri damla6defada buharı difüzyon yöntemleri kullanarak gibi görünüyor.
Genel olarak, bir protein kristalleşme için bir enerji bariyeri çekirdekleşme – kristal oluşumu ilk termodinamik adımda desteklemek için geçti gerekir. Protein çözüm thermodynamically istikrarlı bir devlet için supersaturation taşımak için sipariş ve son olarak bir faz geçiş ikna etmek için protein çözüm ile ilgili bazı değişkenler değiştirilmesi gerekir. Gibi değişkenleri konsantrasyonu protein çözüm, çevresel değişiklikler genellikle (Örn., sıcaklık, nem), çözücü özellikleri (Örneğin, pH, iyonik gücü), konsantrasyon ve arabellek özellikleri, vb7 ,8 -ebilmek çevrilmek örnek parametrelerini genel bakış genellikle sunum çözünürlük diyagramları, çekirdekleşme faz diyagramları veya bile daha ayrıntılı gibi farklı modları sağlar Faz diyagramlar aracılığıyla temsil Burada üç boyutlu veya daha karmaşık diyagramları dikkate8,9,10gelebilir açıklamaları. Kalan parametreleri sürekli6,11tutarken başka bir parametre, bir fonksiyonu olarak protein konsantrasyonu ana değişken olduğu yerde en çekici faz diyagramları genellikle iki boyutlu türleridir. Bir veya birkaç hücre çekirdeği oluşmuş bir kez daha büyük kristaller toplu bir çözüm ek protein yukarıya alarak büyüyebilir. Mikro – ve nanocrystal üretimi için amaçlayan, böyle bir geleneksel kristalizasyon yaklaşım çözüm içinde mevcut olan kristalleri az sayıda nedeniyle artık mümkün değildir. Nanocrystalline süspansiyonlar genellikle böylece öyle ki bir maxima örnek mevcut çekirdekleşme olayların kristalizasyon yolu ayarlamalara gidilmesi zorunda kristal varlıklarda zengin olmak zorunda. Sonuç olarak, bu kadar şimdi keşfedilmemiş çekirdekleşme yolları da henüz tam olarak anlaşılır12,13değildir proteinler için araştırma bazı yeni, gerektirir. Daha önce bahsedilen faz diyagramı temelleri üzerinde bağlı olarak, klasik teori yeni bir hipotez için nerede çekirdekleşme iki aşamalı mekanizması olarak anlatılan biçimde genişletilmiştir: ilk olarak, protein yoğun bir geçiş gerçekleşir (yoğun sıvı Faz) ve ikinci, bir daha yüksek dahili sipariş (kafes mimarisi ile kristal çekirdek)14,15,16zengin yoğun faz bir geçiş. Protein kristalizasyon için birçok faktör duyarlıdır ve kristalizasyon tarifleri için farklı büyüklükte kristaller neden yeniden ne zaman, bu nedenle tarifleri her zaman önceki bilgiye güvenemezsiniz. Yeni anlayışlar gerekir her bireysel protein hedef için kurulacak: arabellek oluşturma, saflık ve istikrar protein çözünürlük, vbörnek, kesin bilginin düzeltilmesi.
Dinamik ışık saçılma olduğunu bugün için analiz ve optimizasyon boyutu-geniş bir soruşturma olması parçacıkları nedeniyle protein kristalizasyon süreçlerin köklü bir yöntem: nanocrystals ve küçük microcrystals monomeric proteinler üzerinden. Yöntemi çözüm parçacıkların Albert geçmesi ve bu hareket ortalama hızı viskozite orta ve parçacık geometri ve partikül büyüklüğü, termal enerji tarafından belirlenir patlatır. İlk başta, sıvı orta bir lazer kullanımı ile tutarlı bir ışık kaynağı tarafından aydınlatılır. Moleküller tarafından dağınık ışık bir kesişim deseni oluşuyor. Parçacıklar sürekli hareket halinde olduğundan kesişim deseni de kalıcı olarak değiştirir. Belirli bir yöne bakarken, şiddeti dalgalanmalar görülebilir. Bu dalgalanmalar tarafından Albert hareket neden parçacık hareketi şimdi gösteriliyor. Ölçülen şiddeti dalgalanmalar bir otokorelasyon işlevi (ACF) hesaplanır. ACF bir analizini bir ölçü birimi-ecek vermek hız dağılımı (daha doğrusu difüzyon katsayısı) parçacıklar ve Stokes-Einstein denklemi kullanarak, bir parçacık RADIUS dağıtım17dönüştürülür. Çeşitli yayınlar ve kitap18,19DLS işlevselliği ve çalışma prensibi ile ilgili daha fazla bilgi bulunabilir.
Burada biz uygulamak ve bir benzersiz otomatik kristalizasyon aygıt, XtalController900, XtalController teknoloji6tam olarak geliştirilen interaktif protein kristalizasyon deneyler izlemek için yükseltilmiş sürüm açıklar. Bu teknik bir yüksek kimlik ve çekirdekleşme olaylar gerçek zamanlı olarak izleme, kristalizasyon faz diyagramı kesin bir manevra izin için potansiyel gösterir. Bu belirli kristalizasyon yordamı amacı protein kristalizasyon yüksek kaliteli protein mikro – ve mikro odaklı sinkrotron x-ışını kaynakları, elektron kırınım, kullanan uygulamalar için uygun olan nanocrystals elde etmek için en iyi duruma getirmektir veya SFX.
Kristalizasyon cihaz izlemek ve değiştirilmiş buharı difüzyon yöntemi üzerinde dayalı bir kristalizasyon deney sırasında çok önemli parametreler işlemek için tasarlanmıştır. Bu teknik izleme ve tüm aşamaları, kesin bilgi ve protein çözüm kristalizasyon faz diyagramı boyunca kontrolünü sahip olmasını sağlayan bir protein kristalizasyon denemeyi Puanlama in situ üzerinde DLS analizi dayalı sağlar örnek süspansiyon.
Kristalizasyon aygıt kristalizasyon damlacık gerçek zamanlı izleme izin veren bir CCD kamera bağlı bir deneysel odası (Şekil 1) oluşmaktadır. Kamera yaklaşık 2.5 µm maksimal uzamsal çözünürlük sağlayan farklı büyütme lensler ile donatılmış bir mikroskop adapte olduğunu. Zaman içinde örnek ağırlık evrimi izlemek için bir vericiyi microbalance deneysel odası çekirdeğidir. Kristalizasyon yordamı protein damla microbalance yerleştirilen bir siliconized coverslip üzerinde yerleştirildiği bir oturma bırak buharı difüzyon deney karşılık gelir. Hangi precipitant toplama, / katkı ek veya örnek buharlaşma tarafından neden olduğu, kilo değişiklikleri, damlacık, microbalance bir algoritma kesin girişine yakın zaman içinde protein ve precipitant konsantrasyon hesaplanması için verir alan . Buna ek olarak, sıcaklık ve bağıl nem gibi önemli kristalizasyon parametreleri tam olarak izlenir ve kontrol.
Kristalizasyon deney gerçekleştirmek için aygıt precipitant ve su toplama için picoliter ölçekte çalışmak (ücretsiz piezoelektrik pompalar başvurun) iki mikro-dozaj sistemleri ile donatılmıştır. Böyle küçük miktarda madde ile çalışarak, konsantrasyon gradyanlar ve protein damlacık içinde konveksiyon fenomen en aza indirilir. Piezoelektrik pompaları ana rolü precipitant veya su, protein damlacık doğal buharlaşma için tazminat olarak kullanılan örneğin ikinci eklenmesidir. Mikro dozaj sistemleri bir madde eklenmesi dikte edebilirsiniz özellikleri bir dizi var. Bu tür özellikleri şunlardır: damlacıkları sayısı ikinci, genişlik ve yükseklik madde akışı yörünge, vbeklendi bir madde eklemek için tekrarlama oranı. Ayrıca, pompalar konumunu el ile maddeler ilavesi protein damlacık içine için kesin bir konum sahip olmasını sağlayan ayarlanabilir.
Kristalizasyon açılan benzersiz geribildirim kontrollü manipülasyon olası değişiklikler protein oligomeric devlet bütün deneysel prosedür boyunca gösterebilir situ DLS veri elde edilir. Teknik dağılımının böylece bilinmeyen protein ile ilgili mekanizmalar açığa parçacık boyutu zaman içinde sürekli değerlendirme sağlar. DLS optik donanımları stratejik coverslip alanının altında coverslip geçmek ve in situ moda protein damlacık yoluyla daha fazla dedektör ve lazer ışını izin yerleştirilir; Bu nedenle, yalnızca değişiklikleri damlacık içinde DLS yolundan kaydedilir. Kolay kullanım izin vermek için cihaz iki açıklıklar vardır: bir ön kapı için bir Kullanıcı Mikro dozaj sistemleri çekim konumunu ayarlayabilirsiniz böylece en iyi coverslip ve hangi-ebilmek var çıkarmak, üst kapaktan konumlandırma hem de doğruluğu ile yeni bir protein dro ayarlama Plet coverslip üzerinde.
Söz konusu aygıtı kullanarak etkileşimli kristalizasyon yöntemi boyutu denetimli üretim protein kristalleri için güvenilir bir tekniktir. Birçok kristalizasyon Yöntem şu anda mevcut olmasına rağmen kristalizasyon hakkında bilgi içinde mekanizması kendisi kolayca ulaşılabilir değildir. Genel olarak, geleneksel kristalizasyon yöntemleri uygulayarak kristalizasyon faz diyagramı, bir deney başladıktan sonra rotasını değişen sadece birkaç imkânına sahip bir çözüm yalnızca sınırlı kontrol sağlar. Bir kristalizasyon gerçekleştirirken deneme ve böyle bir otomatik kristalizasyon teknolojinin birleştiğinde situ ile DLS, büyük bir anlaşma bilgi faz diyagramı geçişler hakkında elde edilir. Genel olarak, amorf çökelti ve homojen çekirdekleşme indüksiyon ile sonuçlanan bölgeleri birbirine yakın faz diyagramı vardır. Bu nedenle, Parçacık dağılımı hakkında gerçek zamanlı bilgileri temel alarak kristalizasyon damlacık ders işleyerek, yavaş yavaş çekirdekleşme doğru kristalizasyon koşullar ayarlayarak bir protein yağış önlemek mümkün olduğunu ve kristal oluşumu.
Günümüzde, birçok kristalizasyon koşulları precipitant çözümleri Polietilen glikol (PEG) türevleri yaygın olarak mevcut nerede yer alır. Böyle bileşikler genellikle pipetting veya dağıtımı için zorluklar sahip bir yüksek viskozite var. Mevcut durumda çalışmada, picolitre aralıklarla eklenmesi mümkün kılmak çok ince kılcal damarlar precipitant dağıtımı için kullanılan mikro dozaj sistemleri uygulanır. Sonuç olarak, son derece ağdalı maddelerle çalışan bazı sınırlamalar vardır. Son deneyler bir dizi içinde sistem aşağıdaki PEG ortamlarda kullanarak olumlu sonuçlar verdi: PEG200 %50, PEG3000% 20, PEG6000 %10, PEG800010%. Şimdiye kadar yalnızca söz konusu çözümleri test rağmen Mikro dozaj sistemleri a eriyik viskozitesi azaltmak için kullanılan bir özel Isıtma mekanizması içerir. Precipitant protein kullanıldığında dikkate alınması gereken tuz çözümleri başka bir faktördür. Yüksek konsantrasyonlu tuzları ile çalışırken, küçük bir miktar yüzeysel Mikro dozaj pompası sırasında precipitant ek engelleme neden Mikro dozaj sistemi, meme, kristalize; çok yüksek bir bağıl nem deneysel odasında mevcut olsa bile. Bu sorunu aşmak için deneme böylece tuz nozzle dan kaldırılabilmesi için beklemeye gerekiyor. Bu özel işlem gerektirebilir ve hataları precipitant toplama aşamasında ortaya çıkarabilir.
Tür otomatik kristalizasyon deneyler yapılırken elde edilebilir değerli bilgilerini temel alarak, bu teknik aynı zamanda protein kristalizasyon fiziksel kimya yönlerini araştırma çalışmaları için uzatılabilir. Çekirdekleşme ve kristal büyüme tepki oranları elde edilen ve bir deneme sıcaklık, büyüme partikül büyüklüğü ve protein gibi tasvir zaman-bağımlılık bilgilere dayanarak ve precipitant hesaplanan kinetik fenomen vardır konsantrasyon.
The authors have nothing to disclose.
Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-sonda” Hibe Sözleşmesi No 637295 ve BMBF grant 05K16GUA ve “Hamburg merkezi için Ultrafast üzerinden destek kapsamında fon yazarlar kabul Görüntü-yapısı, dinamiği ve kontrol maddenin atomik ölçekli”Mükemmellik küme Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |