Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas
Summary
Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm3.
Abstract
Intercambio de nutrientes y gases entre la madre y el feto se produce en la interfase de la sangre materna intervelloso y la vasta red capilares vellosa que compone gran parte del parénquima de la placenta humana. La red capilar vellosa distal es la terminal de la fuente de la sangre fetal después de varias generaciones de ramificación de los vasos que se extienden hacia fuera desde el cordón umbilical. Esta red tiene una envoltura celular contigua, la capa de barrera de trofoblasto sincitial, que evita la mezcla de sangre fetal y la sangre materna en el que está continuamente bañado. Insultos a la integridad de la red capilar placentaria, que ocurre en enfermedades como la diabetes, hipertensión y obesidad, consecuencias presente riesgos de salud graves para el feto, bebés y adultos. Para definir mejor los efectos estructurales de estos insultos, se desarrolló un protocolo para este estudio que refleja la estructura de la red capilar del orden de 1-2 mm3 en donde uno puede investigar sus características topológicas en su completa complejidad. Para lograr esto, se disecan los racimos de vellosidades terminales de placenta y la capa del trofoblasto y el capilar endothelia immunolabeled. Estas muestras se clarifican entonces con un nuevo tejido claro proceso que hace posible adquirir pilas de imagen confocal a z-profundidades de ~ 1 mm. Las representaciones tridimensionales de estas pilas son luego procesadas y analizadas para generar medidas de la red capilar básica tales como volumen, número de ramas capilares y extremos de la rama capilar, como validación de la idoneidad de este enfoque para caracterización de la red capilar.
Introduction
Nuestra comprensión de la placenta en desarrollo y sus patologías es, en gran medida, limitada a inferir relaciones espaciales entre las vellosidades adyacentes y capilares contenidos derivados de las secciones histológicas. En este estudio, hemos abordado este problema mediante el desarrollo de los medios para generar renders de (3D) tridimensionales de redes capilares placentarias humanas que son convenientes para el análisis de las características de la red capilar (por ejemplo, ramificación, solidez). Para ello hemos combinado coloración inmunofluorescente con dos productos de limpieza del tejido comercial, Visikol-1 y Visikol-2 (en adelante como solución 1 solución 2).
La placenta humana es un complejo enorme de los vasos sanguíneos situados en la interfase entre la sangre intervelloso de la madre y el feto en desarrollo. Extendiéndose hacia fuera desde su inserción en la placa coriónica, el cordón umbilical se ramifica en una red de arterias y venas que ramifique para cubrir la superficie coriónica con una elaborada red vascular. Sus extremos entonces penetran hacia abajo en el interior o la profundidad del disco placentario, donde se someten a varias generaciones más ramificadas y terminan en las vellosidades terminales y sus contenidos redes capilares, el sitio del intercambio de gases, nutrientes, y metabólicas desechos entre la sangre fetal y materna.
Insultos a la red capilar placentaria durante el desarrollo tienen consecuencias duraderas para la salud del feto, recién nacido y el adulto emergente 1,2,3. Debido a patologías relacionadas con el embarazo como aborto espontáneo, restricción del crecimiento intrauterino, la preeclampsia y la diabetes 4,5,6 allí es un alto valor a desarrollar métodos de medición y caracterización de las redes capilares vellosas placentarias. Un obstáculo importante es que las redes vasculares placentarias abarcan una amplia gama de escala. Las redes vasculares superficiales pueden ser tan grandes como 4-5 mm de diámetro. Los terminales capilares vellosos son del orden de 10 -20 μm de diámetro; la placenta contiene más de 300 km de vasos sanguíneos 7. En la actualidad, hay algunas técnicas fáciles de usar y rápidas que pueden captar estos extremos de la escala del buque. Hasta la fecha, sólo un pequeño número de vellosidades puede hacerse por microscopia. Por ejemplo, Jirkovska et al se centró en la vellosidad placentaria en término, combina la microscopia confocal con seriales secciones ópticas a intervalos de 1 μm de secciones gruesas de 120 μm; no hay datos sobre el número de muestras estudiadas ni estadísticas recibieron 8. Se identificaron estructuras capilares, y contorno de las vellosidades y los tubos capilares fueron dibujados a mano, con trazos exportados por análisis de imagen. Mientras que los autores discuten las implicaciones de sus hallazgos para la “creciente red vascular vellosa”, dichas conclusiones son problemáticos cuando sólo “término” (36 + semanas edad gestacional) tejido se estudia. Asimismo, Mayo et unal. y Pearce et al. confiaron en el tejido de la misma edad, para sus simulaciones de sangre transferencia de flujo y el oxígeno, pero sus análisis se limitaron a solamente unos término, vellosidades terminales 9,10 . Estereología también se ha aplicado al estudio de la estructura de los vasos vellosos. Pero una vez más, el foco ha sido generalmente en embarazos posteriores entregando a niños liveborn con uno o más embarazo complicaciones 11,12.
Hasta hace poco, la microscopia confocal se limitaba a imágenes a 100-200 μm de profundidad del tejido debido a la absorción de la excitación y la emisión de la fluorescencia por el tejido que lo recubre 13 . Aunque tejido claro e histología 3D han sido ampliamente descritos en la literatura y hay numerosos métodos para el tejido, claro muchos son inadecuados para el uso con los tejidos en general, ya que dañar irreversiblemente morfología celular a través de la hiperhidratación de proteínas o eliminación de los lípidos. Por lo tanto, no es posible validar que estos resultados son indicativos del propio tejido y no artefactos de procesamiento mientras que nuestro tejido claro proceso es una técnica reversible que es capaz de validar contra la histología tradicional. Claro de tejido implica generalmente uno de tres enfoques principales: 1) uniforme que empareja del índice de refracción (RI) de los componentes tisulares por inmersión en soluciones coincidentes de RI, que elimina la dispersión de la luz acumulada causada de lentes debido a la continua fluctuación de bajo RI (citosol) y altos componentes de RI (proteína/lípidos); 2) remover componentes lípidos a modo de incrustación en hidrogel y utilizando la electroforesis, difusión para quitar los componentes de lípidos; 3) expansión/desnaturalización de la estructura de las proteínas para permitir la mayor penetración de solventes para fomentar la uniformidad de RI 13. Mientras que estos enfoques pueden representar los tejidos transparentes y permiten generar representaciones 3D de biomarcadores, estas representaciones 3D son de cuestionable valor clínico ya que es difícil determinar si estas imágenes son indicativas de las propiedades del tejido o del tejido claro proceso. Por otra parte, ya que nuestro tejido claro es reversible estándar histológica o immunohistochemistry puede aplicarse al mismo tejido para evaluar si las alteraciones son clínicamente significativas.
Este estudio presenta un análisis de 47 muestras vellosos distales de un total de 23 embarazos clínicamente normales y electivo terminados entre gestación y partos normales de dos termino 9-23 semanas terminados. Inmunofluorescencia de etiquetado de trofoblasto y endothelia ha permitido un análisis cuantitativo y automatizado de cambios en las redes vasculares vellosas y su complejidad.
Con este protocolo, había aislado y había analizado previamente vellosidades terminales y sus redes capilares en una escala no es posible. Este enfoque, cuando se aplica al desarrollo de la red capilar y velloso a través de la gestación identificará aquellas propiedades que son la base para el nacimiento de un niño sano. Cuando se aplica a los estudios de embarazos complicados, también aclarará cuando y cómo las patologías placentarias modifican los árboles vellosos y las redes de capilares que la envoltura, y cómo éstos inciden en el bienestar fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Junta de revisión institucional aprobó la colección de tejidos vellosos placentarios para la fijación de formalina de embarazos terminados electivo. Antes de que los procedimientos se realizaron, una breve revisión de su expediente médico tomó nota de la edad materna, paridad y confirmó la ausencia de médicos subyacentes (p. ej., hipertensión, diabetes y lupus) o fetales (anomalías cromosómicas o estructurales, crecimiento anormal) fue realizado. La hoja de datos y las muestras obtenidas fueron et…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la oficina de estado de Nueva York para personas con discapacidades y placentaria Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
Referencias
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