Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립
Summary
여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.
Abstract
인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.
Introduction
FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성
Protocol
Representative Results
Discussion
점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
Referencias
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