Двухэтапный подход к исследовать ранние - и поздно этапы формирования органа в модели птичьего: тимуса и паращитовидных желез органогенеза парадигмы
Summary
Эта статья содержит обновленный подход к классической перепела курица Химера системы для изучения формирования органа, комбинируя Роман in vitro и in ovo экспериментальных процедур.
Abstract
Птичий эмбриона, как экспериментальная модель, был крайне важное значение для семенных открытий в биологии развития. Среди несколько подходов, формирование перепела курица химер и пользования chorioallantoic мембрана (CAM) для поддержания развития внематочной тканей даты в прошлом веке. В настоящее время сочетание этих классических приемов с помощью последних в vitro методологий предлагает новые перспективы для дальнейшего изучения формирования органа.
Здесь мы описываем двухэтапный подход к изучению ранних – и поздно этапах органогенеза. Вкратце эмбриональных область, содержащая территории предполагаемого органа изолирован от перепела эмбрионов и выращивать в пробирке в системе organotypic (до 48 ч). Культурной ткани впоследствии привитым CAM куриного эмбриона. После 10 дней в ovo развития полностью сформированные органы получаются из привитых тканей. Этот метод также позволяет модуляции сигнальные пути регулярные отправления фармакологических агентов и генетические манипуляции ткани во всем in vitro и in ovo развития шаги. Кроме того развитие тканей могут быть собраны в любое время окна для анализа их профиль экспрессии генов (с использованием количественного PCR (ПЦР), microarrays и т.д.) и морфологии (оценены с обычными гистологии и иммунохимии).
Описанная процедура экспериментальной может использоваться как инструмент следовать формирования органа за пределами птичьего зародыша, из ранних стадиях органогенеза полностью сформирована и функциональных органов.
Introduction
Птичий эмбрионы были широко используется в семенных биологии развития исследований. Основные преимущества птичьего модели включают в себя возможность открыть яйцо, относительно легкий доступ к эмбрион и способности выполнять микроманипуляции. Некоторые примеры включают классические перепела курица Химера системы для изучения клеток судьба1применение конкретных факторов роста эмбриона2и рост внематочная клеточных структур в CAM1,3, 4.
Чтобы получить новый взгляд на различных этапах формирования органа, мы недавно разработали метод, который сочетает в себе прививочных методы манипуляции в vitro эмбриональных тканей5. Двухэтапный подход позволяет дискриминации и разведки из обоих ранних – и поздно этапах органогенеза, который часто ограничены из-за ткани весьма динамичного и сложного взаимодействия2. Кроме того, отсутствие подходящей ткани специфических маркеров часто ограничивает использование генетически модифицированных животных моделей6. Этот новый метод двухэтапный подход во многом преодолевает такие ограничения.
Для изучения ранних стадиях формирования органа, на первом шаге, перепелиные эмбриональных территории, включающей рудимент перспективных орган изолирована и вырос в пробирке organotypic системы в течение 48 часов. В этот период фармакологические модуляции конкретных сигнальных путей может выполняться путем добавления наркотиков культуры среднего5,7. Кроме того, культивировали тканей может быть собраны на любой стадии роста в пробирке и зондируемой для экспрессии генов (с помощью методов, таких как ПЦР, microarrays и т.д.).
На втором шаге, 48 h культурной ткани затем привитым CAM эмбриона курицы (c) на эмбриональных день (E) 8 (Уэ8) (гамбургер и Гамильтон (HH)-этапы 33-35)8. Кулачок ведет себя как поставщик сосудистой питательных веществ и позволяет газового обмена1,3,4 привитые тканей, позволяя ее развития в ovo для более длительных периодов времени. Этот экспериментальный шаг особенно хорошо подходит для изучения поздних стадиях органогенеза, как полностью сформированные органы могут быть получены после 10 дней в ovo развития5,9,10,11 . Морфологический анализ производится легко обычных гистология для подтверждения надлежащего органа формирование и происхождения доноров клеток могут быть идентифицированы по иммуногистохимия, используя вегетационных антитела (т.е., МАБ перепелиные PeriNuclear (QCPN)). Инкубационный период CAM графтов может быть вырос в присутствии фармакологических агентов и собранные на любой стадии развития для оценки прогрессирование органогенеза.
Двухэтапный подход, описанные здесь, в глубине, уже работают в Фигейреду и др. 5 для изучения общего развития зачаток птичьего околощитовидной железы/тимуса. Соответственно присущие особенности эмбриональных территорий и этапы развития участвующих в органогенеза тимуса и паращитовидных желез будет представлен ниже.
Тимуса и паращитовидных желез эпителия, хотя функционально различных, вытекают из энтодермы глоточные Чехлы (PP)12. В птичий, эпителия этих органов происходят из третьего и четвертого PP эндодермы (3/4PP)12, в то время как у млекопитающих тимуса эпителия происходит от 3PP и эпителия паращитовидных желез вытекает из 3PP и 3/4PP в мышь и человека, соответственно,1314.
Один из самых ранних этапов формирования этих органов является появление дискретных тимуса и паращитовидных желез домены в общий зачаток. В куриный эти домены может быть идентифицирован в situ гибридизация, с конкретными молекулярных маркеров, E4.515. По мере развития этих органа зачатки индивидуализировать и отдельно от глотки, в то время как тонкий мезенхимальных капсула, образованный нейронные крест производные клеток, их окружает (на E5; HH-stage 27). Позже на эпителии тимуса колонизирована гемопоэтических прогениторных клеток (в E6.5; HH-stage 30)12.
Как в классических исследований перепела курица1,12двухэтапный подход является особенно полезным для изучения формирования гемопоэтических/лимфоидных органов, а именно5тимуса. Как explant перепел, с орган рудимент, привитые в куриного эмбриона до колонизации клеток кроветворных прародителю, химерных тимус формируется с курица кровь прогениторных клеток проникновения перепелиные тимуса эпителиальные коллегой. Таким образом, этот метод является полезным инструментом для изучения вклада гемопоэтических клеток в развитии птичьего онко/лимфоидной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшим аспектом для успеха этого метода является качество цыпленка и перепелиные яйца. Учитывая длительный инкубационный периоды, особенно в ovo assay, хорошее качество куриного яйца улучшает жизнеспособности ставок (до 90%) в конце процедуры. Для достижения этой цели, тест яйца от р…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны António Cidadão, Изабель Alcobia и Leonor Паррейра для критических чтении рукописи, Падма Akkapeddi для видео повествование, и делать Vitor Proa от службы гистология Instituto de Histologia e Biologia Развития, прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa, для технической поддержки. Мы признательны особенно Паулу Caeiro и Уго Силва из Unidade de audiovisuais (аудиовизуальных единица), прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa за их выдающуюся приверженность производства этого видео. Мы признаем Leica Microsystems за любезно предоставление стереоскоп, оборудованных с видео системы и Interaves – Sociedade Агро-Pecuária, С.А. вклад с перепелиным оплодотворенных яиц. Эта работа была поддержана прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
Referencias
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
