ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה
Summary
פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.
Abstract
דנדריטים הן ההשתקפויות מסועף של נוירון, מורפולוגיה דנדריטים משקף סינפטית הארגון במהלך הפיתוח של מערכת העצבים. דרוזופילה זחל עצביים דנדריטים arborization (da) הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה של דנדריטים העצבית ותפקוד גנים בהתפתחות מערכת העצבים. ישנם ארבעה סוגי נוירונים da. השיעור הרביעי הוא שהמורכב ביותר עם דפוס מסעף המכסה כמעט את כל שטח הקיר גוף הזחל. אנחנו קודם לכן שאפיינו את השפעת להשתיק את דרוזופילה ortholog של SOX5 על השיעור הרביעי arborization דנדריטים עצביים המורכבות (NDAC) באמצעות ארבעת הפרמטרים: האורך של דנדריטים, את פני השטח של כיסוי דנדריט, המספר הכולל של ענפים, ואת המבנה מסעף. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה של ניתוח כמותי NDAC, המורכב לנתיחה זחל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ושגרות התמונה ניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. תובנות חדשות ההתפתחות העצבית da ומנגנונים הבסיסית שלה לשפר את ההבנה של תפקוד ולספק רמזים אודות הסיבות הבסיסיות של נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות.
Introduction
דנדריטים, אשר ההשתקפויות מסועף של נוירון, לכסות את השדה שמקיף חישה וסינפטית תשומות של הנוירון אחרים1,של הנוירונים2. דנדריטים הם מרכיב חשוב של היווצרות סינפסה ולשחק תפקיד קריטי שילוב תשומות סינפטית, וכן הפצת הגירוי אלקטרוכימי של נוירון. Arborization דנדריטים (da) הוא תהליך שבו נוירונים בצורת הדנדריטים חדשות וסניפים ליצירת הסינפסות חדש. פיתוח, המורפולוגיה של דא, כגון צפיפות סניף ודפוסי הקיבוץ, הם תוצאה של תהליכים ביולוגיים רב שלבי, נמצאים בקורלציה גבוהה תפקוד. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה לניתוח כמותי של המורכבות arborization dendritric עצביים דרוזופילה.
המורכבות של דנדריטים קובעת את סוגי סינפטית, קישוריות, תשומות מן השותף נוירונים. מסעף דפוסים, הצפיפות של דנדריטים מעורבים עיבוד האותות מתכנסת אל שדות דנדריטים3,4. דנדריטים מקבל את הגמישות עבור התאמה בהתפתחות. למשל, איתות סינפטית יש השפעה על הארגון דנדריט נוירון המגע במהלך שלב התפתחותי, את מערכת העצבים בוגרת5. הקמת קישוריות עצביים מסתמך על מורפוגנזה ועל התבגרותם של דנדריטים. מום של דנדריטים מזוהה עם תפקוד לקוי. מחקרים הראו כי חריגות של da נוירון מורפוגנזה עשוי לתרום אטיולוגיה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), ומחלת לו גריג / נוירודגנרטיביות (ALS)6,7,8. שינויים סינפטיים מופיעים בשלב המוקדם של AD, בתאום עם הירידה ואת ירידת ערך של נוירון פונקציה7,8. עם זאת, הפרטים של איך דנדריט פתולוגיה תורמת פתוגנזה מחלות ניווניות אלה נשאר חמקמק.
הפיתוח של דנדריטים מוסדר על ידי גנים אשר קידוד רשת מורכבת של הרגולטורים, כגון משפחת ונ ט של חלבונים9,10, גורמי שעתוק ליגנדים התא קולטנים משטח11,12 . דרוזופילה da נוירונים מורכב ארבע כיתות (מחלקה אני, II, III, IV), של איזה מחלקה IV דה נוירונים יש מסעף הדפוסים המורכבים ביותר, יש כבר מועסקים כמערכת ניסיוני רב עוצמה עבור יותר הבנה מורפוגנזה13, 14. במהלך תחילת מורפוגנזה, ביטוי ו/או RNAi להחרשת גנים class IV דה נוירונים לגרום לשינוי דפוסי מסעף ודנדריט גיזום13. חשוב לפתח שיטה מעשית לניתוח כמותי של arborization הדנדריטים עצביים.
אנחנו הראו בעבר כי להחרשת דרוזופילה ortholog של SOX5, Sox102F, הוביל דנדריטים קצר יותר של נוירונים da, מורכבות מופחתת בשיעור הרביעי da נוירונים15. כאן, אנו מציגים את ההליך של ניתוח כמותי על המורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה. פרוטוקול זה, משנת המתודולוגיה המתוארת הקודם, מספק שיטה קצרה assay הפיתוח של נוירונים חושי דה. זה מדגים תיוג תמונות של נוירון da השלישי לחלל זחל לגוף החומה16,17,18,19. זה פרוטוקול יקר עבור חוקרים המעוניינים לחקור את NDAC ואת הבדלים התפתחותיים ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
דנדריטים זה innervate האפידרמיס הם אזורי קלט של נוירונים, מורפולוגיות שלהם לקבוע כיצד המידע התקבל, מעובד על ידי נוירונים בודדים. פיתוח דנדריט מורפולוגיה משקף ג’ין אפנון של הארגון דנדריט. הנוירון da זחל דרוזופילה של מערכת העצבים ההיקפית הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח דנדריט בגלל: 1) הדמיון פונקצי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ויליאם א אימר לסיוע טכני הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי לקרן תרופה לאלצהיימר [R.E.T], המכון הלאומי לבריאות [R01AG014713, R01MH60009 אל R.E.T; R03AR063271, R15EB019704 ל א. ל.], ואת הקרן הלאומית למדע [NSF1455613 ל א. ל.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
Referencias
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
