Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules
Summary
Nous présentons un protocole visant à enquêter sur les biomarqueurs d’expression ARNm de cellules dérivées de périoste (PDC) induites par la vitamine C (vitamine C) et 1, 25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes.
Abstract
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont présentes dans divers tissus et peuvent être différenciés dans nombreux types de cellules, y compris les ostéoblastes. Parmi les sources dentaires de MSCs, le périoste est un tissu facile d’accès, ce qui a été identifié pour contenir les MSCs dans la couche de cambium. Toutefois, cette source n’a pas encore été largement étudiée.
Vitamine D3 et 1,25-(OH)2D3 ont été démontrés pour stimuler la différenciation in vitro de MSCs en ostéoblastes. En outre, vitamine C facilite la croissance cellulaire osseuse et de la formation de collagène. Cependant, aucune étude n’a encore étudié les effets de la vitamine D3 et la vitamine C sur MSCs.
Nous présentons ici une méthode permettant d’isoler les MSCs du périoste alvéolaire humaine et examiner l’hypothèse que 1,25-(OH)2D3 pourraient exercer un effet ostéo-inducteurs sur ces cellules. Nous avons également enquêter sur la présence de MSCs dans le périoste alvéolaire humaine et évaluer la prolifération et l’adhérence de cellules souches. Pour évaluer la capacité de la vitamine C (sous forme de contrôle) et de diverses concentrations de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8et 10−7 M) pour influer sur les biomarqueurs d’ARNm clés dans MSCs ARNm isolés de la phosphatase alcaline (ALP), OS sialoprotéine osseuse (BSP), liaison de base le facteur alpha-1 (CBFA1), collagène-1 et ostéocalcine (OCN) sont mesurés à l’aide de la PCR en temps réel (RT-PCR).
Introduction
Bien que les nombreuses techniques pertinents ont été développés ces dernières années, os des restes de reconstruction limité par des contraintes multiples et estimer que l’étendue de la nécessaire reconstruction est souvent impossible. Augmentation des tissus-dur est requis pour atteindre les objectifs esthétiques et fonctionnels en plus un taux de réussite à long terme favorable. Méthodes couramment utilisées pour ces procédures comprennent une greffe osseuse autogène et allogène, xénogreffe et alloplastique une greffe osseuse. Parmi les différents types de greffe osseuse, greffe osseuse autogène est considérés comme les plus efficaces. Cependant, morbidité site donneur, vascularisation compromise et de disponibilité limitée de tissus1 ont été des inconvénients majeurs pour une greffe osseuse autogène. En outre, la greffe osseuse allogénique et xénogreffes ont été associés à la transmission de la maladie. Actuellement, les greffons osseux synthétiques sont largement utilisés pour résoudre ces problèmes. Cependant, avec leur manque de potentiel ostéogénique, résultats cliniques varient considérablement. Des matériaux tels que la cellulose sont associés aux fluctuations de volume, infection et un manque de force.
Augmentation osseuse à l’aide de génie tissulaire a suscité un vif intérêt. Dans cette technique, cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement utilisées pour promouvoir la différenciation ostéoblastique, qui sont ensuite repiqués sur le site de la perte osseuse pour réaliser la réparation osseuse. Cette procédure est actuellement appliquée en thérapie cellulaire. Réalisation de reconstruction osseuse par l’extraction d’une quantité limitée de tissus est plus simple et moins invasive par rapport aux autres méthodes.
Le rôle potentiel de MSCs comme un outil pour des thérapies à base cellulaire visant à régénération dentaire est un intérêt émergent entre les divers groupes de recherche. Des études ont confirmé que MSCs peuvent différencier les types de tissus : la moelle osseuse, membrane adipeuse, synovial, pericyte, l’OS trabéculaire, cordon ombilical humain et tissus dentaires2,3. Les sources communes de MSCs comprennent la moelle osseuse, tissu adipeux et les tissus dentaires. Comparé avec MSCs provenant du tissu adipeux et de la moelle osseuse, les avantages des cellules souches dentaires sont un accès facile et une morbidité moindre après la récolte. Par rapport aux cellules souches embryonnaires, MSCs provenant de tissus dentaires apparaissent nonimmunogenic et ne sont pas associées à des préoccupations éthiques complexes3.
En 2006, la société internationale de thérapie cellulaire recommandé d’utiliser les normes suivantes pour identifier les MSCs : tout d’abord, MSCs doivent être capables d’y attacher au plastique. Deuxièmement, MSCs doivent être positive pour les antigènes de surface CD105 CD73 et CD90 et négative pour les marqueurs pour les monocytes, macrophages et cellules B en plus des antigènes hématopoïétiques CD45 et CD344. Comme un critère final, MSCs doivent être en mesure de différencier en trois types de cellules dans des conditions normales de la différenciation in vitro : les ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes,4. A ce jour, six types de cellules souches dentaires humaines ont été isolés et caractérisés. Le premier type a été isolé à partir de tissu humain pulp, appelée pulpe dentaire postnatal cellules souches5. Par la suite, trois autres types de MSCs dentaires ont été isolés et caractérisés : cellules souches provenant de dents caduques exfoliée6, le ligament alvéolo-dentaire7et la papille apicale8. Plus récemment, de dérivés de follicule dentaire9, de dérivés de tissus gingivaux10, bourgeon dentaire tige cells(DBSCs)11et kyste périapical MSCs (hPCy-MSCs)12 ont également été identifiés.
Château Friedenstein fut le premier à définir MSCs13. MSCs présentent une prolifération haute potentielle et peuvent être manipulés pour différencier avant d’être transplanté, qui suggère qu’ils sont des candidats idéaux pour des procédures régénératrices10.
Bien que la plupart des études utilisent la moelle osseuse comme une source de cellules souches, cellules dérivées de périoste (PDC) ont également été récemment utilisé14. Le périoste est plus facilement accessible que ce qui est de la moelle osseuse. Par conséquent, dans cette technique, nous utilisons périoste alvéolaire pour éliminer le besoin pour les incisions supplémentaires pendant la chirurgie et à réduire la morbidité post-opératoires chez les patients. Le périoste est un tissu conjonctif qui forme la paroi extérieure des os longs et se compose de deux couches distinctes : la couche fibreuse externe composé de fibroblastes, collagène et fibres élastiques15et la couche intérieure riche en cellules cambium en contact direct avec la surface osseuse. La couche de cambium abrite une population de cellules mixtes, principalement les fibroblastes16, ostéoblastes17, péricytes18et une sous-population critique identifié sous MSCs19,20,21. La plupart des études ont rapporté que PDC est comparables, voire supérieurs, à des cellules souches issues de la moelle osseuse (BMSC) en os de guérison et de régénération22,23,24. Le périoste est facilement accessible et expositions excellente efficacité régénératrice. Cependant, peu d’études ont porté sur le périoste25,26,27.
Concernant la réparation osseuse, la pratique clinique actuelle implique la transplantation de cellules progénitrices périostique amplifié dans les échafaudages favorables. Des études récentes ont mis l’accent sur l’acquisition de cellules souches dans des régions défectueuses et utilisant des cellules souches pour la régénération de tissu20. Dentistes a également anticipent l’application future de la régénération osseuse parodontale en traitements parodontaux et implants dentaires. Au sujet du site donneur, le périoste peut être facilement récolté par les chirurgiens dentistes généraux. Cela se compare favorablement contre les cellules stromales de la moelle, comme le périoste sont accessibles au cours de la chirurgie buccale systématique. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’établir un protocole pour la récolte de PDC et d’évaluer la morphologie, la viabilité et la prolifération des cellules souches humaines périoste.
Métabolites de la vitamine D affectent l’in vivo minérale de l’OS équilibre dynamique. Une étude a indiqué que 24R,25-(OH)2D3 forme active de vitamine D est essentielle à la différenciation ostéoblastique des humains MSCs (CSM)28. L’homéostasie osseuse et la réparation sont réglementés par un réseau de vitamine D3 métabolites, dont 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) est la plus biologiquement active et pertinente dans la régulation de la santé des os. Vitamine D3 est essentiel pour la calcification29. Dans une étude sur des souris de Kunming blanc 2-d-ancien, les corps embryoïdes chez les souris ont indiqué que les suppléments de vitamine C et de vitamine D de promouvoir efficacement la différenciation des ostéoblastes dérivés ESC30. Parmi ses autres activités biologiques, 1,25-(OH)2D3 stimule la différenciation in vitro des CSM d’ostéoblastes, qui peuvent être surveillés basées sur l’augmentation dans l’activité de l’enzyme phosphatase alcaline (ALP) ou le gène de l’OCN expression.
Peu d’études ont détecté une relation dose-effet des traitements combinés avec la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 aux humains PDC en mettant l’accent sur l’ingénierie tissulaire osseuse. Par conséquent, dans cette étude, nous examinons les concentrations optimales pour un traitement simple ou combiné de 1,25-(OH)2D3 et vitamine C pour induire la différenciation ostéogénique du PDC humaine. Ce protocole vise à déterminer si une population de cellules isolée du périoste alvéolaire dentaire contient des cellules avec un phénotype MSC et de savoir si ces cellules peuvent être élargis dans la culture (in vitro) et différenciées pour former le tissu désiré . En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes. La deuxième partie de l’étude évalue les effets de la vitamine C et de 10−10, 10−9, 10−8et 10−7 M 1,25-(OH)2D3 sur l’activité ostéogénique du PDC. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer les fonctions de la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 au cours de la différenciation ostéoblastique des PDC par activité de l’ALP et pro-ostéogénique gènes, tels que de l’ALP, collagène-1, OCN, BSP et CBFA1. En outre, cette étude détermine les conditions optimales ostéo-inducteurs pour PDC humain basé sur ces résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une modalité thérapeutique développée récemment, à savoir les tissus techniques entraînant MSCs, offre de nombreux avantages. MSCs, qui sont présents dans plusieurs types de tissus, sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en divers tissus mésodermiques fonctionnelle des cellules37 et autres cellules comme les ostéoblastes.
Le périoste sert une niche de cellules progénitrices et comme un approvisionnement riche vascularisation de l’OS, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’Institutional Review Board a approuvé le protocole d’étude pour clinique recherche de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 4728B-101 et 103-4223C). Cette étude a été financée par Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 et NMRPG3C0151). Ce manuscrit a été édité par Wallace édition académique.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
| 35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
| Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
| avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| indomethacin | Sigma | I7378 | |
| insulin | sigma | 91077C | |
| insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
| MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
| Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
| transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
| reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
| OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
| reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
| BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
| reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
| Commercial ALP primers | |||
| Commercial CBFA1 primers |
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