Un protocollo per l’estrazione di un chaperone periplasmico metalli di transizione nel contesto dei suoi partner di associazione nativo e caratterizzazione biofisica dei suoi contenuti di substrato di raggi x di fluorescenza e radiometal l’assorbimento è presentato.
Dimostriamo un metodo scalabile per la separazione del Periplasma batterica dal citoplasma. Questo metodo viene utilizzato per purificare la proteina periplasmica ai fini della caratterizzazione biofisica e trasferimento del substrato di misura tra compartimenti periplasmico e citoplasmatici. Limitando con attenzione nel momento in cui il Periplasma è separato dal citoplasma, lo sperimentatore può estrarre la proteina di interesse e ogni scomparto individualmente per il substrato senza contaminazione di riporto tra i compartimenti di analisi. La proteina estratta dal frazionamento possa poi essere ulteriormente analizzata per determinazione della struttura tridimensionale o profili di grippaggio del substrato. In alternativa, questo metodo può essere eseguito dopo incubazione con un radiotraccitore per determinare l’assorbimento percentuale totale, come pure la distribuzione dell’elemento tracciante (e quindi in metallo trasporto) attraverso diversi compartimenti batteriche. Sperimentazione con un radiotraccitore può aiutare a distinguere tra un substrato fisiologico e substrato artefactual, come quelle causate da mismetallation.
Fluorescenza a raggi x può essere utilizzato per scoprire la presenza o l’assenza di metallo incorporazione in un campione, come pure di misurare le variazioni che possono verificarsi in metallo incorporazione come prodotto di condizioni di crescita, condizioni di purificazione, e/o condizioni di cristallizzazione. Fluorescenza a raggi x fornisce anche una misura relativa di abbondanza per ogni metallo, che può essere utilizzato per determinare il picco di assorbimento di energia metallo migliore da utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering. L’assorbimento radiometal utilizzabile come metodo per convalidare la natura fisiologica di un substrato individuato dalla fluorescenza di raggi x, così come la scoperta di nuovi substrati di supporto.
Nei batteri gram negativi, piscine citoplasmatiche degli atomi di metalli di transizione sono aumentate e rifornite gli importatori (cassetta ATP-binding) di membrana interna ABC che attenuano metallo traslocazione attraverso la membrana interna. Periplasmica proteine che legano il substrato a-1 Cluster (SBPs) compongono un gruppo di accompagnatori che legano gli atomi metallici direttamente e li traghetto attraverso il Periplasma di consegnarli a cognate ABC importatori1. Altri ammassi di SBPs sono dedicati al trasporto di substrati, quali metallo chelato (Cluster A-2), carboidrati (cluster B e D-1) e gli aminoacidi (cluster B, C, F-2 e F-4); Tuttavia, indipendentemente dal substrato, SBPs seguire un evolutivamente conservata c-morsetto piega2. Il meccanismo proposto generalizzato per trasferimento substrato SBP comprende la c-clamp subendo una serie di contorsioni che assomigliano a una pianta carnivora3. In genere, Cluster a-1 SBPs purificare in una forma di holo (metallo-bound), anche se studio di questi SBPs è limitata dalla difficoltà nella generazione di apo (senza metallo) forme di proteina per sperimentazione4. Ad oggi, strategie per studiare apo Cluster SBPs a-1 sono stati limitati a mutagenesi, dialisi e parziale denaturazione con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) acido chelante5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. dati strutturali che proviene da questi esperimenti suggeriscono che Cluster a-1 SBPs non può seguire con precisione il meccanismo di Venere acchiappamosche. Attualmente manca dalla letteratura è un metodo di produzione di apo a-1 SBPs Cluster in vivo utilizzando partner di legame fisiologico.
Dimostriamo per la prima volta utilizzando il frazionamento delle cellule per purificare YfeA, un Cluster a-1 SBP da Yersinia pestis, agente eziologico della peste, che è stato convertito in forma apo attraverso l’interazione con suo fisiologico importatore YfeBCDE ABC cognate nella cella. Indichiamo che YfeA è nel modulo apo di spettroscopia a raggi x in dispersione di energia (EDS), anche conosciuto come fluorescenza a raggi x. Inoltre dimostriamo di YfeBCDE funzionalità combinando il frazionamento delle cellule con gli studi di assorbimento del metallo radioattivo altamente sensibile per distinguere tra l’assorbimento del metallo attraverso la membrana esterna e metallo importazione attraverso la membrana interna. L’uso di un tracciante radioattivo consente il rilevamento della quantità di pg/L di metalli, molto inferiore al limite di rilevazione per tali tecniche ad accoppiamento induttivo come spettrometria di massa al plasma (ICP-MS) o spettroscopia di assorbimento atomico (AAS). Questo consente per la minima perturbazione del sistema oggetto di studio. Inoltre, i tradizionali metodi elencati spesso richiedono grandi volumi di campione, post-elaborazione aggiuntiva e più lunghi tempi di ritorno, che non sono tipici per radiotraccitore saggi. Così, usando un radiotraccitore fornisce un metodo pratico e semplice per il monitoraggio distribuzione del metallo e l’assorbimento all’interno di una cella. Rimane essere determinata se un apo a-1 SBP Cluster prodotta utilizzando questo metodo echo le osservazioni strutturali alla pratica corrente usata per generare la proteina apo.
Il frazionamento delle cellule è un metodo consolidato per la separazione dei compartimenti cellulari per lo scopo implicito di probing specificamente loro contenuto in isolamento12. Il frazionamento delle cellule è comunemente usato per confermare la posizione di una molecola durante il ciclo cellulare o misurare l’attività di un particolare comparto13. Ad esempio, attività di trasporto del metallo può essere analizzata tramite sondaggio compartimenti cellulari per substrato metallico. L’integrazione di frazionamento cellulare consente la distinzione e confronto tra l’assorbimento del metallo attraverso la membrana esterna e trasferimento del metallo attraverso la membrana interna. Questi processi quindi possono a sua volta essere misurati nel tempo. Nel caso di purificazione della proteina, i metodi più comuni di lisi cellulare e separazione di componenti solubili da componenti insolubili sono rottura meccanica (cioè, macinazione, miscelazione), omogeneizzazione ad alta pressione (cioè, pressione francese cell press, cella un distruttore) e frequenze ultrasoniche (cioè., sonicazione)14. Uso di frequenze ultrasoniche per lisare cellule è generalmente più adatti per piccoli volumi; Tuttavia, la sonicazione è conosciuto per generare calore eccessivo che può denaturare la proteina. Per evitare di generare calore eccessivo, frequenze ultrasoniche sono solitamente applicate in sequenziale brevi raffiche, che possono richiedere molto tempo e inavvertitamente degradano molecole di DNA in frammenti più piccoli. Inoltre, più costosi sonicazione sonde possono essere richiesti per gli esperimenti di analitici e preparativi, come ogni sonda ha una gamma limitata per il volume di campione che può essere elaborato. Uso di alta pressione a lisare cellule evita generando calore eccessivo durante la lisi cellulare di refrigerazione componenti di stampa delle cellule di pressione francese prima della lisi o un disgregatore cella in un ambiente freddo come una cella frigorifera di funzionamento. Come sonde di sonicazione, potrebbero essere necessario essere acquistati per elaborare una vasta gamma di volumi di campione più insiemi di componenti di stampa di pressione francese delle cellule. Pressione francese cella stampa assembly sono facili da collegare ma scomodo da usare e pulire, può essere pesante da spostare e sono incline a intasamento da campioni di densi. Vantaggi di utilizzare frequenze ultrasoniche e sistemi ad alta pressione per lisare cellule comprendono campione alto recupero, capacità di elaborare campioni multipli con minima contaminazione incrociata, e forza di taglio regolabile, che può essere adattato per l’ottimizzazione di lisi di una vasta gamma di tipi di campioni. Ottimizzazione può verificarsi regolando la frequenza ultrasonica, durata di fiammate, pistone pressione libbre per pollice quadrato (psi) e il numero di passaggi attraverso la stampa. Uso di rottura meccanica a lisare cellule può essere la strategia tecnicamente più banale e meno costoso per lisi cellulare. Rottura meccanica può presentare particolari difficoltà nel recupero del campione e non è l’ideale per trattare più campioni. Rottura meccanica è più delicata ai campioni di alta pressione o frequenze ultrasoniche, ma non è elevato throughput ed è incline alla lisi inefficiente. Una significativa limitazione sperimentale di rottura meccanica, omogeneizzazione ad alta pressione e frequenze ultrasoniche, è la rottura incontrollabile dell’intera architettura cellulare tale che dopo lisi, tutti i componenti cellulari acquose sono mescolati insieme. Inoltre, tutti i compartimenti cellulari non perturbino allo stesso tempo; Pertanto, contenuto di compartimenti che lyse presto può essere soggetto a forze dirompenti in corso più di contenuto dei compartimenti che lyse tardi. Frazionamento cellulare permette poco costoso, tecnicamente semplice, efficiente basata su vano separazione del contenuto della cella, evitando la necessità di attrezzature costose e l’esposizione del campione a forze dure, dirompente.
Nel caso la SBP, importato substrato viene reintrodotto a potenzialmente apo proteina e proteina holo si rigenera durante la lisi, prima della cromatografia a valle o altre tecniche di purificazione. L’inclusione di chelante EDTA durante Lisi presenta un ulteriore ostacolo, dove affinità di metallo come un primo passo di purificazione della proteina non è possibile perché EDTA sarà striscia di metallo dalla resina di cromatografia e prevenire15di legame alle proteine. Una soluzione semplice ed economica è il frazionamento delle cellule da shock osmotico, dove centrifugazione differenziale e reagenti di laboratorio comuni permettono al ricercatore di estrarre delicatamente sufficienti proteine per l’analisi funzionale. Frazionamento di shock osmotico utilizza un cambiamento in due fasi di pressione osmotica per separare i compartimenti cellulari. In primo luogo, un buffer ipertonico induce le cellule a crenato come acqua lascia ogni cella e in secondo luogo, un buffer ipotonico induce le cellule a gonfiarsi come acqua ri-entra ogni cella. Controllando attentamente quanto tempo le cellule si gonfiano, le membrane esterne possono essere selettivamente lisate (a causa di accumulo di pressione osmotica dall’acqua in ingresso), così lo svuotamento loro contenuto nel buffer. Conservazione delle membrane interne garantisce che il contenuto citoplasmatico vengono mantenuto in Sferoplasti e è facilmente separato dalla periplasmico contenuto mediante centrifugazione.
YfeA è un polispecifico SBP in grado di legare il ferro, manganese e zinco atomi16. Le proporzioni relative di metallo incorporato può essere modificato secondo il completamento del metallo durante la crescita e analizzata mediante fluorescenza a raggi x come è disponibile presso Advanced Photon fonte16 di Argonne National Laboratory. Fluorescenza a raggi x permette al ricercatore di profile rapidamente una vasta assemblea di metalli senza la necessità di grandi dimensioni o cristalli di qualità di diffrazione e può anche ricavare dati dalla soluzione del precipitato o proteinico della proteina.
Fluorescenza a raggi x può rapidamente rivelare risultati imprevisti come, in questo caso, il substrato primario di YfeA essere zinco e non documentata substrati fisiologici ferro o manganese16. Se usato prima di raccogliere dati di scattering di raggi x, fluorescenza a raggi x è in grado di informare lo sperimentatore nel disegno sperimentale, ad esempio quali energia metallo gli spigoli per utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering. Altrettanto utili come determinare l’abbondanza relativa di un metallo, fluorescenza a raggi x può anche determinare se un metallo è assente in un campione, fornendo un rapido metodo di separazione cristalli che contengono la proteina apo da proteina holo e stima in metallo potenza del segnale senza la necessità di elaborazione dei dati richiede molto tempo. All’identificazione di un campione con un forte segnale di metallo, la lunghezza d’onda precisa da utilizzare per la raccolta di dati anomalo x-ray scattering può essere determinata dall’esplorazione di dispersione anomala di multiplo-lunghezza d’onda (MAD).
Questo protocollo dettagliato è destinato per aiutare gli sperimentatori di nuovi correttamente eseguire il frazionamento delle cellule e rendere l’utilizzo efficace di sincrotrone beamline hardware di profilo contenuto totale di metallo e lo studio delle proteine metallo-leganti.
Il frazionamento delle cellule è un utile strumento per sondare in modo specifico il contenuto di un compartimento cellulare e può servire come un utile strumento per l’estrazione di piccole molecole quali atomi del metallo, così come le macromolecole quali proteine. Vale la pena notare quel frazionamento delle cellule non è una tecnica di assoluta e può essere soggetto senza attenzione alla miscelazione/risospensione, temperatura di incubazione e incubazione a errori. Miscelazione incompleta può causare Lisi membranosa minimal e frazionamento così trascurabile, frazionamento a temperatura ambiente possa causare rapida lisi di entrambe le membrane con conseguente contaminazione della frazione periplasmica con contenuto citoplasmatico, e tempi di incubazione prolungato possono anche provocare la lisi eccessiva e quindi contaminazione di frazione. Un ragionevole compromesso per raggiungere lisi della membrana esterna relativamente completi ed efficienti (preservando la membrana interna) è di incubazione di 20 minuti sul ghiaccio nel buffer ipotonico frazionamento. Un’altra considerazione è il metodo di estrazione, dove duro estrazione mediante agitazione o vortice potrebbe compromettere la qualità dell’estratto quali causando l’aggregazione proteica. Si consiglia di mescolare delicatamente come spatola, inversione o ad aspirazione di pipetta per mantenere il materiale di alta qualità per analisi a valle. Purificazione da frazionamento cellulare preparativa può avvenire con efficienze variabili come evidenziato dalla Figura 1. In un esperimento, YfeA ha cominciato come 8% del contenuto periplasmico Estratto (Figura 1), mentre in un altro esperimento, YfeA ha cominciato come 17% del contenuto periplasmico (Figura 1). Queste differenze possono derivare da diversi motivi come condizioni di espressione variabile (aggiunta di EDTA ai media crescita può aumentare l’espressione di geni regolati da meccanismi di fame come regolamento di pelliccia del promotore Yfe), l’uso ripetuto di congelati stock permanente ed errori umani. Invece di regolare i tempi di incubazione, si raccomanda di scalabilità della preparazione. Purificazione dalla frazione Periplasma è consigliabile includere un’eluizione di pendenza lineare dal passaggio cromatografico scambio anionico. Un’eluizione di pendenza di passaggio è una strategia di eluizione gli usi discreti e bruschi cambiamenti nella composizione della fase mobile (cioè., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, ecc.). Un’eluizione di pendenza lineare è una strategia di eluizione che utilizza il cambiamento graduale in mobile fase composizione (cioè, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 millimetri di NaCl, ecc.). Una sfumatura di passaggio è utile per la separazione di molecole che hanno diverse affinità per la fase stazionaria e un’eluizione di pendenza lineare è utile per la separazione di molecole che hanno affinità simile per la fase stazionaria. Nel caso di purificazione della proteina con nessun tag di depurazione artificiale (per migliorare l’affinità per la fase stazionaria) da un compartimento cellulare che è ricco di specie di proteina unica, un’eluizione di pendenza lineare è consigliabile separare proteine di noninterest che possono hanno simile affinità per la fase stazionaria come la proteina di interesse. In genere, una resa di 1-2 mg di purificato apo YfeA è prevista da ogni litro di cultura espressione YfeA dalla sua endogeno promotore di Y. pestis .
Fluorescenza a raggi x è una tecnica che permette al ricercatore di rapidamente determinare il contenuto di metallo in un campione e informare lo sperimentatore imprevisto incorporazione di metallo che sarebbe altrimenti sconosciuto. Anche se EDTA è incluso nel buffer di frazionamento ipertonica per rimuovere il metallo liberamente associati o libero, YfeA derivato dalla frazione Periplasma può contenere alcune proteine holo. Dato che il trasporto del metallo è un processo dinamico, forse il contenuto proteico di holo proviene da YfeA che ancora ha donato non suo carico al YfeBCDE. Vale la pena notare che fluorescenza a raggi x solo misura il contenuto totale di metallo e non indica se il metallo è ordinato in un reticolo cristallino, o specificamente legato ad una proteina. Per determinare se metallo è ordinato in un reticolo cristallino e/o specificamente legato a una molecola di proteina, x-ray scattering dati raccolta e trattamento è richiesto. Tuttavia, fluorescenza a raggi x permette per la valutazione del campione rapido di contaminazione di metallo e/o integrazione di proteine residue holo. Tempo di radiazione di sincrotrone è limitato e non c’è sempre tempo per elaborare una strategia per la raccolta dati di scattering di raggi x su ogni campione, così la fluorescenza a raggi x è una tecnica importante per molti cristalli di screening e la priorità per i campioni che raggi x devono essere raccolti dati di scattering. Fluorescenza a raggi x permette inoltre la raccolta di dati da campioni che non può rifrangere i raggi x. Durante la raccolta dati di fluorescenza di raggi x, a volte il segnale può essere molto debole e gli spettri risultanti uninformative. Per migliorare la potenza del segnale, sia per la fluorescenza a raggi x o scansione MAD, considerare aumentando il tempo di esposizione e/o diminuire l’attenuazione del fascio di raggi x. Quando un campione viene identificato per la raccolta dati di scattering di raggi x, si raccomanda di raccogliere dati di scattering di raggi x su una parte diversa del campione di quello che è stato usato per fluorescenza a raggi x e MAD scansione per ridurre al minimo il danno da radiazione, migliorare la qualità dei dati collezione e ridurre al minimo ogni potenziale per la riduzione del segnale anomalo.
Rilevamento di traccianti radioattivi richiede quantità nanomolari di materiale o meno, e l’uso di tali rivelatori come agenti di monitoraggio molecolare fornisce un metodo semplice e altamente sensibile di sondare i processi cellulari. Il saggio di radiometal sopra indicato consente di determinare l’assorbimento del metallo totale, distribuzione attraverso compartimenti cellulari, così come i tassi di assorbimento. Infatti, ogni punto del tempo di dati richiede un frazionamento di 40 minuti; Tuttavia, come viene raggiunto ogni punto del tempo, le cellule sono immediatamente pellettate e incubate in tampone salino elevato (Figura 5passaggio 1). Radiometal misure dei media, scartati tampone salino elevato (Figura 5passaggio 1) e le frazioni periplasmica e citoplasmatiche dopo (Figura 5punto 3) indicano che l’incubazione di alta tampone salino rimuove correttamente tutti i rimanente metallo libero non associati che si sono protratte dopo la centrifugazione iniziale dopo aver raggiunto il punto di tempo. La centrifugazione iniziale rimuove la maggior parte (fino all’80%) di metallo libero non associato e la centrifugazione dopo incubazione nel buffer sale alto rimuove anche ulteriore rimanenti metallo libero non associati. Qualsiasi metallo libero non associato persistente non dovrebbe influenzare significativamente il trasporto del metallo durante il frazionamento di 40 minuti. L’influenza di frazionamento 40 minuti il trasporto intracellulare del metallo è un’altra considerazione per interpretazione prudente dei dati. Praticamente il protocollo intero frazionamento si verifica sopra ghiaccio, a parte la centrifugazione secondo 30 tra i passaggi. Tempo di trasporto corso esperimenti hanno indicato che il mantenimento delle cellule a 4 ° C abroga trasporto metallo20,21,22; in metallo Pertanto, poiché gli esperimenti si verifica sopra ghiaccio, il frazionamento di 40 minuti non dovrebbe aumentare significativamente livelli di metallo nel Periplasma di citoplasma e i livelli del metallo dovrebbero essere rappresentante dei punti di tempo in cui le cellule sono state inizialmente centrifugalized.
Determinazione dell’assorbimento relativo in diversi compartimenti cellulari può aiutare a comunicare dati XFS, confermano la natura fisiologica di un substrato così come attivare l’investigatore sondare ulteriormente i dettagli molecolari di un meccanismo. Ad esempio, aggiunta di mutagenesi genetica agli esperimenti di assorbimento radiometal fornisce un metodo diretto per rafforzare residui funzionali chiave o molecole coinvolte nel trasporto di substrato. Vantaggi di radiometal assorbimento esperimenti e analisi includono turnaround, alto rendimento, elevata riproducibilità e parallelizzazione di esperimenti di confrontare le condizioni di crescita e costrutti genetici.
The authors have nothing to disclose.
I dati sono stati raccolti anche a GM/CA@APS, che è stato finanziato, in tutto o in parte con fondi federali dal National Cancer Institute (ACB-12002) e il National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Questa ricerca ha utilizzato risorse di origine di fotone avanzate (APS), un US Department of Energy (DOE) Office of Science utente Facility operati per l’ufficio DOE di scienza di Argonne National Laboratory sotto contratto no. DE-AC02-06CH11357. Impiego della fonte del fotone avanzate è stato sostenuto dal u. s. Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto contratto no. W-31-109-ITA-38.
Vorremmo riconoscere la UAB Comprehensive Cancer Center – impianto di massa spettrometria/proteomica ha condiviso (P30CA13148-38) per la loro assistenza nell’analisi di spettrometria di massa.
C.d.r. è stata sostenuta da una sovvenzione della University of Alabama a Birmingham Office di diversità, l’equità e l’inclusione. L.L.R. è stato sostenuto dal reparto di radiologia dell’Università di Alabama a Birmingham. Il dipartimento dell’energia, Office of Science, isotopo programma supportato 52produzione Mn e concedere A.V.F.M. sotto DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |