Summary

Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell’analisi genetica.

Abstract

Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d’argento è un metodo ampiamente usato per l’individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d’argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l’efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d’argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.

Introduction

Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento1. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l’individuazione di genotipi eterozigoti2. Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economicamente importanti3,4.

I prodotti di PCR di marcatori SSR comunemente sono separati mediante elettroforesi dell’agarosi o gel di poliacrilammide e poi visualizzati con la macchiatura d’argento o sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio. Macchiatura d’argento di frammenti di DNA in gel di poliacrilammide è più sensibile rispetto al altri colorazione metodi5,6 ed è stato ampiamente utilizzata per rilevare i frammenti di DNA ad esempio SSR marcatori7.

Come molte tecniche di laboratorio biologico, macchiatura d’argento del gel di poliacrilammide è costantemente migliorato dal suo primo segnalato come una tecnica di visualizzazione frammento nel 19798. La tecnica è stata inizialmente modificata per il rilevamento dei frammenti del DNA da Bassam et al. 6 nel 1991 e poi migliorato da Sanguinetti e colleghe9 nel 1994. Il metodo è stato ulteriormente ottimizzato nelle ultime pochi decenni6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Tuttavia, la maggior parte di queste versioni aggiornate dei protocolli hanno ancora alcuni svantaggi, come alta richiesta tecnica e lungo tempo per la fissazione di elaborazione e montaggio6, che limitano l’applicazione di questi protocolli7, 11. Un protocollo ottimale che combina basso costo ad alta efficienza di rilevazione del frammento del DNA è urgente per applicazioni di routine d’argento che macchia nella ricerca biologica.

Inoltre, gel di poliacrilammide può essere diviso in gel di poliacrilammide denaturante e non-denaturante, ed entrambi possono essere utilizzati per l’individuazione di marcatori SSR usando l’argento che macchia il metodo. L’effetto e la risoluzione delle quali non differiscono significativamente, ma non-denaturante del gel di poliacrilammide sono più facile da processo e prendere meno tempo16.

Sulla base della precedente ricerca15, lo scopo di questo studio è di descrivere un argento ottimizzato protocollo dettagliatamente per rilevazione veloce, facile e basso costo di SSR markers in un non-denaturante del gel di poliacrilammide di colorazione.

Protocol

1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl2, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH2O).Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ‘…

Representative Results

Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l’elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l’argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1). Per confrontare l’efficienza di rivelazione d’argento diverso protocolli di co…

Discussion

Il lavaggio del gel dopo l’impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l’efficienza colorazi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato il Natural Science Foundation di Guangdong (2015A030313500), la piattaforma di ricerca di Key International Cooperative provinciali e i principali scientifico ricerca progetto di Guangdong istruzione superiore (2015KGJHZ015), la scienza e Piano per le tecnologie di Guangdong amministrazione del monopolio del tabacco (201403, 201705), la scienza e la tecnologia piano di Guangdong, Cina (2016B020201001), il progetto di formazione nazionale di innovazione per gli studenti (201711078001). Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell’agricoltura. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.

Materials

PCR master mix (Green Taq Mix) Vazyme Biotech Co. Ltd, China #P131-03
50-2000 bp DNA Ladder Bio-Rad, USA #170-8200
DL500 DNA marker Takara Bio Inc., Japan #3590A
Tris base Sangon Biotech Shanghai, China #77-86-1
Boric acid Sangon Biotech Shanghai, China #10043-35-3
EDTA-Na2 Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #6381-92-6
Acrylamide Sangon Biotech Shanghai, China #79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide Sangon Biotech Shanghai, China #110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine Sangon Biotech Shanghai, China #110-18-9
Ammonium persulfate Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #7727-54-0
Bind-silane Solarbio Beijing, China #B8150
AgNO3 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China #7761-88-8
Formaldehyde Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #50-00-0
NaOH Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #1310-73-2
Acetic acid Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #64-19-7
Na2CO3 Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #497-19-8
Ethanol Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #64-17-5
HNO3 Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #7697-37-2
Na2S2O3.5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China #10102-17-7
Eriochrome black T(EBT) Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #1787-61-7
Plastic tray Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China
TS-1 Shaker Qilinbeter JiangSu, China
BenQ M800 Scanner BenQ, China
DYY-6C Power supply Beijing Liuyi Instrument Factory, China
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China

Referencias

  1. Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
  4. Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
  5. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
  6. Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
  7. Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
  8. Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
  9. Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
  10. Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
  11. Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
  12. An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
  13. Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
  14. Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
  15. Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
  16. Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
  17. Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).

Play Video

Citar este artículo
Huang, L., Deng, X., Li, R., Xia, Y., Bai, G., Siddique, K. H., Guo, P. A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel. J. Vis. Exp. (134), e57192, doi:10.3791/57192 (2018).

View Video