創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して
Summary
ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。
Abstract
ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) を分化肝細胞様細胞 (HLCs) 能力は、先天性肝代謝を研究する新たな機会を提供します。ただし、肝疾患を治療するためにされる可能性がありますすることができます小さな分子の同定をサポートするプラットフォームを提供するためにプロシージャは何千もの化合物をスクリーニングと互換性のある文化形式を必要です。ここでは、完全に定義された培養条件、96-well ティッシュの培養皿の肝細胞様細胞に人間 Ips の再現性のある差別化をできるを使用してプロトコルについて述べる.家族性高コレステロール血症患者から生成された iPSC 由来肝細胞由来アポリポ蛋白 B (APOB) を下げるため画面化合物の機能のためにプラットフォームを使用する例もあります。創と互換性のあるプラットフォームの可用性は、肝臓に影響を与える病気の治療薬を識別するために研究者をようにします。
Introduction
まれな疾患を対象とする使用ことができます薬を識別する成功はスクリーニングに使用することができるアッセイの開発に依存しています。仮説またはターゲット ベースの画面 (逆薬理学) は有用だが、疾患の分子基盤の解明を必要とします。表現型画面 (古典的な薬理学) 生化学的経路の詳細な理解の必要性を避けるが、疾患の病態生理を正確にミラー化モデルの開発に頼る。ターゲット ・ ベースのアプローチのための熱意にもかかわらずは、FDA のファーストクラスで医薬品の分析は、表現型の画面がはるかに成功した1をされている明らかにします。このメソッドの全体的な目標は、高スループット スクリーニングのためのプラットフォームを確立する代謝性肝疾患の治療のための小さい分子を識別するために使用することができますです。肝, 肝癌細胞と肝前駆細胞2を含むいくつかの生体外モデルを記載されています。しかし、これらのモデルのほとんどは、制限があります、文化肝代謝不足の病態を要約することができます正確に新しいモデルの必要性があります。最近では、ひと多能性幹細胞遺伝子編集と組み合わせるモデルもアクセス患者することがなく文化のまれな病気のたぐいまれな機会を提供している直接3。患者特有の Ips の使用は、まれな肝疾患の治療のための小分子を発見するツールは概念的には合理的なアプローチ4の可能性を示す報告は少ないがあります。ただし、iPSC 由来の肝細胞を正常に肝代謝5欠陥の治療のための用途に使用することができます薬を識別するために使用するプラットフォームを開設します。
このプロトコルは 96-well 版の肝細胞様細胞にヒトの Ips を区別し、低分子化合物のライブラリを選別するに使用するプロセスを説明します。代謝性肝疾患の例としてエンドポイントによる高コレステロール血症についても説明します。このアプローチは、役割と伝染性肝疾患、代謝性肝疾患、薬物の毒性、その他の肝疾患のコンテキストで小さな分子の応用に関する研究に役立つはずです。
Protocol
1. 人間の文化誘導多能性幹細胞 組換えひと E カドヘリン Fc 融合タンパク質 (E-cad-Fc) または他の行列の hPSC 文化に適したコーティング6 ダルベッコ Phosphate-Buffered 食塩カルシウムとマグネシウム (DPBS (+)) が含まれていると 15 μ g/mL に E-cad-Fc を希釈します。 5 ml の希釈 E-cad-Fc の 100 mm サスペンション ティッシュの培養皿をコートし、少なくと…
Representative Results
肝細胞の生成-細胞のような:図 1では、人間の Ips 細胞肝細胞様細胞への分化過程に発生する変更のタイム フレームについて説明します。E-Cad-Fc に Ips の文化提供します約 2 mm OCT4 多能性マーカーを表す直径植民地 (図 1 aB)。E-カドヘリンのマトリックス上に成長した細胞の?…
Discussion
ターゲット ・ ベース創薬、小さい分子を識別する、特定の蛋白質の活動に影響を与える多くの既存のスクリーニングの努力の焦点となっています。このアプローチは、多数の医薬品、画面反転表現型, 古典的な薬理学に基づいてを提供して臨床的に効果がある1されているファーストクラスの化合物を識別するに成功されています。表現型創薬への不利な点はそれが適切な?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所 (DK55743、DK087377、DK102716、S.A.D に HG006398) によって支えられました。彼らの貢献に対して博士 Behshad Pournasr、博士ジェームズ ・ ヘズロップ ・と蘭静に感謝したいと思います。
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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Citar este artículo
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).