Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores
Summary
Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.
Abstract
Bioeletricidade, sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular, desempenha papéis importantes na sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis e muitos outros processos biológicos, tais como embrionárias padronização do desenvolvimento. No entanto, há uma necessidade na vivo monitoramento da atividade elétrica em vertebrados embriogênese. Os avanços dos indicadores de voltagem fluorescente geneticamente codificado (GEVIs) tornaram possível fornecer uma solução para este desafio. Aqui, descrevemos como criar um indicador de tensão transgénicos zebrafish usando o indicador de tensão estabelecida, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciais de ação 1), por exemplo. O kit de Tol2 e um promotor de zebrafish onipresente, ubi, foram escolhidos neste estudo. Nós também explicar os processos de clonagem de site-specific Gateway Tol2 baseados em transposon zebrafish transgênese e o processo de imagem para tumores de embriões e peixes peixes fase inicial usando regular epifluorescente microscópios. Usando esta linha de peixe, achamos que há mudanças de tensão elétrica celular durante a embriogênese de zebrafish e movimento de larvas de peixes. Além disso, observou-se que em alguns zebrafish tumores de bainha de nervo periférico maligno, o tumor de células foram geralmente polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes.
Introduction
Bioeletricidade refere-se a sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular1. Intercâmbio iônico através da membrana celular e as acoplado mudanças atuais e potenciais elétricas, é essencial para a sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis. Além disso, bioeletricidade e gradientes de íons têm uma variedade de outras funções biológicas importantes, incluindo o armazenamento de energia, biossíntese e transporte do metabólito. Sinalização bioelétrica também foi descoberto como um regulador de formação embrionária padrão, tais como machados do corpo, o ciclo celular e de diferenciação celular1. Assim, é fundamental para a compreensão de muitas doenças congênitas humanas que resultam do Regulamento mis deste tipo de sinalização. Embora a braçadeira do remendo tem sido amplamente utilizada para gravação de células únicas, é ainda longe do ideal para o monitoramento simultâneo de várias células durante o desenvolvimento embrionário em vivo. Além disso, pequenas moléculas sensíveis de tensão também não são ideais para aplicações em vivo devido às suas especificidades, sensibilidades e toxicidades.
A criação de uma variedade de geneticamente codificado fluorescente tensão indicadores (GEVIs) oferece um novo mecanismo para superar este problema e permite a fácil aplicação estudar o desenvolvimento embrionário, mesmo que eles foram originalmente destinados para monitoramento neural células de2,3. Dentre os GEVIs atualmente disponíveis é o acelerado Sensor de potenciais de ação 1 (ASAP1)4. É composto por um loop extracelular de um domínio sensor de tensão de tensão sensível fosfatase e uma circular permutada proteína verde fluorescente. Portanto, ASAP1 permite a visualização de alterações de potenciais elétricas celulares (polarização: verde brilhante; despolarização: verde-escuro). ASAP1 tem 2 ms sobre-e-off cinética e pode seguir abaixo do limite potencial mudança4. Assim, esta ferramenta genética permite um novo nível de eficácia no monitoramento em tempo real bioelétrica em células vivas. Mais compreensão dos papéis de bioeletricidade no desenvolvimento embrionário e muitas doenças humanas, tais como câncer, derramará nova luz sobre os mecanismos subjacentes, que é fundamental para a prevenção e tratamento da doença.
Zebrafish provaram um poderoso modelo animal para estudar a biologia do desenvolvimento e doenças humanas, incluindo o câncer5,6. Eles compartilham genes ortólogos de 70% com os humanos, e eles têm biologia vertebrada semelhante7. Zebrafish fornecer cuidados relativamente fácil, um tamanho de embreagem grande de ovos, genética tractable, transgênese fácil e desenvolvimento embrionário externo transparente, que faz com que um sistema superior na vivo de imagem5,6. Com uma grande fonte de linhas de peixes mutantes já presentes e um genoma completamente sequenciado, zebrafish fornecerá uma variedade relativamente ilimitada de descoberta científica.
Para investigar na vivo em tempo real atividade elétrica das células, aproveitamos o sistema modelo de zebrafish e ASAP1. Neste artigo, descrevemos como incorporar o biosensor fluorescente tensão ASAP1 no genoma da zebrafish usando Tol2 transposon transgênese e visualizar a atividade elétrica celular durante o desenvolvimento embrionário, movimento larvas de peixe e no tumor ao vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora as atividades elétricas nível celular e tecidos durante o desenvolvimento embrionário e doença humana foram descobertas há muito tempo atrás, na vivo elétrica mudanças dinâmicas e seus papéis biológicos ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Um dos maiores desafios é Visualizar e quantificar as alterações elétricas. Tecnologia de braçadeira do remendo é um quebra-through para acompanhamento de células únicas, mas sua aplicação aos embriões vertebrados é limitada, porque ele…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho de pesquisa reportado nesta publicação foi apoiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio número R35GM124913, programa de incentivo de PI4D Universidade de Purdue e PVM interno competitivo Programa de fundos de pesquisa básica. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos agentes de financiamento. Agradecemos a construção Tol2, Michael Lin para a construção de ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon para a promotora ubi construir através de Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
Referencias
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