Microdissection de tissu rénal primaire Segments et intégration avec la technologie de nouvelle construction exempte d’échafaudage
Summary
Tissulaire rénales constructions offrent une solution pour la pénurie d’organes et les effets délétères de la dialyse. Nous décrivons ici un protocole se rapportant au micro disséquer les reins murins pour l’isolement des segments cortico-médullaire. Ces segments sont implantés dans des constructions cellulaires exempte d’échafaudage, formant organoïdes rénale.
Abstract
Transplantation rénale est maintenant une thérapie ordinaire pour insuffisance rénale terminale. Cependant, avec environ 96 000 personnes sur la liste d’attente et seulement un quart de ces patients atteignant la transplantation, il y a un besoin urgent d’alternatives pour ceux qui ont le défaut des organes. Afin de diminuer les conséquences néfastes de dialyse ainsi que les frais de soins de santé dans l’ensemble qu’elle engage, enquête active est en cours à la recherche de solutions alternatives aux greffes d’organes. Implantables tissulaire rénales constructions cellulaires sont une telle approche faisable pour remplacer la fonction rénale perdue. Décrite pour la première fois, voici la microdissection des reins murins pour l’isolement de vie corticomédullaire segments rénales. Ces segments sont capables d’intégration rapide au sein des constructions d’exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste qui peut permettre une connexion rapide avec vascularisation hôte une fois implantée. Reins de souris adultes ont été achetés auprès de donneurs vivants, suivies par microdissection stéréoscope pour obtenir des segments rénales 200-300 µm de diamètre. Plusieurs constructions rénales ont été fabriquées en utilisant des segments rénales primaires ne récoltés qu’un seul rein. Cette méthode montre une procédure qui pourrait sauver le tissu rénal fonctionnel des organes qui pourrait autrement être mis au rebut.
Introduction
Insuffisance rénale chronique (IRC) est l’un des défis majeurs de santé publique partout dans le monde actuel1. La prévalence de CKD aux États-Unis dépasse les 14 % de la population totale, avec plus 600 000 américains souffrant de la forme la plus sévère, stade terminal d’insuffisance rénale (terminale IRT)2. Les options de traitement actuelles disponibles pour les personnes souffrant d’insuffisance rénale terminale comprennent la transplantation de dialyse et des reins. Bien qu’environ 25.000 patients subissent chaque année de la transplantation rénale, un nombre important de patients est ajouté chaque année conduisant à une forte disparité entre les personnes en attente d’un organe de sauvetage et les récepteurs de transplantation3. En plus de ses graves effets négatifs sur la longévité et la qualité de vie, dialyse est associé à une charge financière étonnante. En 2014, l’assurance-maladie demandes payées ont totalisé $ 30 milliards pour les patients d’IRT2. Avec un approvisionnement limité orgue et aucune tendance à la baisse apparente chez les patients nécessitant une dialyse, les efforts de recherche visant à identifier des solutions alternatives à la dialyse et transplantation sont toujours importants. Même un délai relativement court dans la nécessité d’une dialyse augmente considérablement nombre du patient des années de vie ajustées pour la qualité et la productivité tout en reportant les coûts liés à la dialyse4,5,6.
Solutions pour la perte de tissu fonctionnel, comme celui de l’insuffisance rénale terminale, sont actuellement à l’étude en génie tissulaire et des laboratoires de médecine régénérative, avec des approches très variées allant de fabrication axée sur l’échafaud organoïde d’organes entiers à l’aide technique DECELLULARISE structures de l’orgue pour implantation cellulaire7,8,9,10,11. Récapitulant les structures rénales complexes des reins marginaux ou mis au rebut que partiellement a été étudiée. En fait, presque 20 % des reins achetés à la transplantation sont abandonnées pour diverses raisons12,13. Le tissu rénal fonctionnel de ces greffes présumés pourrait être utilisé et incorporé dans une ou plusieurs constructions tissulaire. Des études antérieures ont démontré la possibilité de travailler avec ces organes mis au rebut, utilisant les reins de la matrice extracellulaire pour tissus ingénierie fins14,15. Cependant, peu ont utilisé des principaux tissus nephronal des reins en bonne santé pour l’ingénierie tissulaire fins16,17,18.
Une méthode précédemment décrite par Kim et coll. implique isolement de « segments » rénales de reins des rats sains, qui ont été ensuite ensemencés sur des échafauds de (PGA) acides polyglycolique pour construction fabrication16. Cependant, peu d’information est donnée au sujet de la méthodologie exacte dissection et segments ont été obtenus d’une combinaison de hacher fines et de filtration. Nous décrivons une modification du présent protocole, qui produit de la même façon des segments rénales discrètes avec architecture nephronal intact, mais au contraire repose sur des techniques de microdissection. Suivie est effectuées sur des souris adultes vivants, après quoi les reins sont transférés dans le microscope de dissection où la capsule rénale est supprimée et le tissu est disséqué plus loin. Petit calibre 30½ G aiguilles sont utilisées comme instruments de coupe et également comme guide aidant à dissection, comme l’aiguille diamètre est égal au diamètre de la cible des segments rénales. Les segments isolés, en l’espèce murines, rénales maintiennent la viabilité en culture et intègrent avec des constructions cellulaires exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste19. Ces constructions avaient déjà été utilisées à l’ingénieur d’autres organes, y compris un pancréas artificiel bio20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Méthodes utilisées pour vivre le tissu rénal constructions varient grandement en ce qui concerne le type de cellules et de biomatériaux utilisés et dans de nombreux cas, l’ingénieur sont obsolètes ou pas bien caractérisé dans la littérature7. Alors que beaucoup utilisent des approches de cellules souches ou récapitulant les différents composants de l’architecture rénale dans l’isolement, la perspective de recréer artificiellement un organe entier avec plus de 26 types de diffé…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH institutionnels de formation postdoctorale Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
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