Canule implantatie in de Cisterna Magna van knaagdieren
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van de cisterna magna cannulation (CMc), een minimaal invasieve manier om verklikstoffen, substraten en signalering moleculen in de cerebrospinale vloeistof (CSF). In combinatie met de verschillende beeldvormende modaliteiten, kan CMc glymphatic systeem en CSF dynamics beoordeling, zowel als hersenen bestrijkende levering van verschillende verbindingen.
Abstract
Cisterna magna cannulation (CMc) is een eenvoudige procedure die het mogelijk directe toegang tot de cerebrospinale vloeistof (CSF) zonder operatieve schade aan de schedel of de hersenen parenchym maakt. Bij narcose knaagdieren kan de blootstelling van de dura mater door botte dissectie van de nekspieren het inbrengen van een canule in de cisterna magna (CM). De canule, samengesteld door een fijne schuine naald of borosilicaat capillaire, is via een buis van polyethyleen (PE) aan een spuit gekoppeld. Met behulp van een spuitpomp, kunnen moleculen vervolgens worden geïnjecteerd op gecontroleerde tarieven rechtstreeks in de CM, die continu met de subarachnoïdale ruimte. Van de subarachnoïdale ruimte, kunt wij CSF fluxen traceren door convectie stroom in de ruimte van de gerelateerde rond doordringende arteriolen, waar de opgeloste uitwisseling met de interstitiële vloeistof (ISF) optreedt. CMc kan worden uitgevoerd voor acute injecties onmiddellijk na de operatie, of chronische implantatie, met later injectie in narcose of wakker, vrij bewegende knaagdieren. Kwantificatie van tracer distributie in de hersenen parenchym kan worden uitgevoerd door epifluorescence, 2-foton microscopie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI), afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de geïnjecteerde moleculen. Dus, CMc in combinatie met verschillende beeldvormingstechnieken biedt een krachtig instrument voor de beoordeling van het stelsel van glymphatic CSF dynamiek en functie. Bovendien, CMc kan worden gebruikt als een kanaal voor snelle, hersenen bestrijkende levering van signalering van moleculen en metabole substraten die de bloed-hersenbarrière (BBB) anders niet kunnen overschrijden.
Introduction
Cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt het centrale zenuwstelsel (CNS) gedurende de ventriculaire systeem en langs de subarachnoïdale ruimtes, een anatomisch gedefinieerde ruimte in continuüm met de ventrikels, die rondom de hersenen en het ruggenmerg. Een van de hoofdfuncties van het CB is bedoeld als een route voor goedkeuring van de metabolieten en opgeloste stoffen uit de hersenen parenchym. Goedkeuring wordt bevorderd via de recent ontdekte glymphatic systeem1, de hersenen analoog naar de perifere lymfatisch systeem. Hierin, we beschrijven en bespreken de cisterna magna cannulation (CMc), een minimaal-invasieve methode voor de rechtstreekse levering van moleculen in het CB. De CMc is de belangrijkste methode voor het bestuderen van de glymphatic functie. CMc kan bovendien ook worden toegepast voor de studie van CSF dynamiek en voor een snelle, hersenen bestrijkende levering van niet-blood-brain barrière (BBB) permeabele moleculen in de hersenen parenchym, langs de gerelateerde ruimte.
De CMc exploiteert fysiologische principes van CSF dynamiek van het verkeer door middel van het centraal zenuwstelsel aan het leveren van gelabelde tracer moleculen of drugs in de CSF gevulde ruimte van de cisterna magna (CM). Moleculen zijn ingespoten via een canule de Atlantisch-occipitale dural membraan bekleding die de CM.-moleculen dan door CSF bulk stroom in de hersenen parenchym via de paravascular ruimte1 gedragen wordeningeplant. Tracer of contrast agent geïnjecteerd via de CMc volgt de beweging van CB, waarmee de beoordeling van CSF beweging en glymphatic instroom door de intensiteitsniveaus van gelabelde moleculen die worden ingevoerd door de hersenen parenchym kwantificeren. De CMc is compatibel met verschillende beeldvormingstechnieken, inclusief epifluorescence, 2-foton microscopie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Ook deze evaluatie kan worden uitgevoerd zowel in vivo of ex vivo. Bovenal zorgt CMc voor de visualisatie van het systeem van de glymphatic onder anesthesie of tijdens de natuurlijke slaap, evenals in wakker, vrij bewegende dieren.
De CMc-techniek kan worden gebruikt om verschillende aspecten van fluid dynamics in het CB studeren, maar heeft bewezen te zijn met name handig voor het bestuderen van het glymphatic-systeem. Glymphatic activiteit rijdt de convectie stroom van CB van de periarterial ruimte via aquaporin-4 (AQP-4) water kanalen, die in het membraan van astrocytic vasculaire-inwikkeling endfeet worden aangebonden. De convectie stroom maakt de uitwisseling van CB en interstitiële vloeistof (ISF) binnen de hersenen parenchym. CSF/ISF met metabolische afval en opgeloste stoffen wordt vervolgens verwijderd uit de hersenen parenchym via de perivenous ruimte2,3. Uiteindelijk bereikt de CSF/ISF de periferie via het recent beschreven dural lymfevaten4,5. Het glymphatic systeem is cruciaal voor de goedkeuring van schadelijk afval metabolieten zoals amyloid-β2aangetoond. Verder is de glymphatic klaring verminderde in veroudering6, na traumatische hersenen letsel7, en in dierlijke modellen van diabetes8 es9van de ziekte van Alzheimer. Glymphatic activiteit is met name afhankelijk, tonen beduidend hogere activiteit tijdens de slaap of anesthesie in vergelijking met wakkerheid1staat. Inderdaad, jonge narcose dieren vertonen de hoogste glymphatic-activiteit. Experimentele kwantificering van glymphatic activiteit is dus kritisch bij de studie van haar rol in gezondheid en ziekte.
Verschillende studies hebben aangepakt CSF dynamiek en de gegevensuitwisseling met interstitiële vloeistof (ISF) in de hersenen parenchym. De methoden waarmede gelabelde moleculen worden geleverd zijn echter tamelijk invasieve, triggering parenchym hersenbeschadiging en veranderingen in de intracraniële druk (ICP) (Zie review10). Voorbeelden hiervan zijn intraventricular of intraparenchymal injecties waarbij craniotomy of boren van een burr gat in de schedel. Deze procedures hebben aangetoond dat het ICP, aldus verstoren glymphatic functie2wijzigen. Ook, dergelijke invasieve methoden induceren astrogliosis en AQP-4 immunoreactivity in de hersenen parenchym beschadigd gebied en haar omgeving11,12te verhogen. Zoals astrocyten en AQP-4 sleutelelementen van het glymphatic-systeem zijn, is de CMc de methode van keuze voor haar studies. De belangrijkste voordelen van CMc in vergelijking met meer invasieve procedures zijn de handhaving van een intact schedel en hersenen parenchym, vermijden van ICP wijzigingen en astrogliosis, respectievelijk. Dus, opent CMc in combinatie met verschillende imaging tools voor een breed scala aan mogelijkheden om te studeren het glymphatic systeem, maar ook de dynamiek en de mechanismen van vloeistofstromen in homeostase, evenals in diermodellen van neurologische aandoeningen.
De cisterna magna cannulation (CMc) procedure biedt gemakkelijke en directe toegang tot de cerebrospinale vloeistof (CSF). Door het injecteren van verschillende moleculen (bijvoorbeeld TL verklikstoffen, MRI-contrastmiddelen) kan de experimentator hun beweging binnen de CSF compartiment te volgen en de activiteiten beoordelen van het glymphatic-systeem. Het volgende protocol beschrijft zowel de acute CMc, voor injecties onmiddellijk na de chirurgie en chronische innesteling van de canule, waarbij het dier van de chirurgische ingreep voor een latere injectie herstelt. Het belangrijkste verschil tussen de acute en chronische implantatie is dat de chronische implantatie voor de studie van glymphatic activiteit in wakker muizen toestaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een protocol dat wordt beschreven van een procedure voor de cisterna magna cannulation (CMc), die biedt een eenvoudige methode om te leveren van gelabelde moleculen tot het compartiment CSF gepresenteerd. CMc kan de volgende visualisatie van CSF dynamiek, zowel in vivo es ex vivo, met behulp van verschillende beeldvormende modaliteiten of histologie.
Een van de belangrijkste voordelen van de CMc-techniek ligt in de directe toegang tot de subarachnoïdale ruimte zond…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Novo Nordisk Foundation en het National Institute of Neurological Disorders en de beroerte, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. en S.H-R zijn begunstigden van een postdoctorale fellowship en een PhD beurs van de Stichting Lundbeck, respectievelijk.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
Referencias
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
