Summary

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

Published: May 05, 2018
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Summary

El protocolo descrito en este artículo utiliza el músculo levator auris longus (LAL) de ratón para grabar espontánea y nervio postsynaptic potenciales evocados (abrazadera de la corriente) y corrientes (abrazadera de tensión) en la Unión neuromuscular. Uso de esta técnica puede proporcionar ideas claves en los mecanismos de transmisión sináptica en condiciones normales y la enfermedad.

Abstract

Este protocolo describe una técnica para grabar transmisión sináptica de la placa neuromuscular bajo condiciones de corriente abrazadera y pinza de voltaje. Una preparación ex vivo del levator auris longus (LAL) se utiliza porque es un músculo delgado que proporciona una visualización fácil de la placa neuromuscular para empalamiento de microelectrodos en la placa motora. Este método permite la grabación de potenciales de placa miniatura espontáneos y corrientes (mEPPs y mEPCs), potenciales evocados del nervio tapa y corrientes (productos ambientalmente preferibles y EPC), así como las propiedades de la membrana de la placa motora. Resultados obtenidos de este método incluyen el contenido cuántico (QC), número de sitios de lanzamiento de vesícula (n), la probabilidad de liberación de la vesícula (prel), facilitación sináptica y depresión, así como la constante de tiempo de la membrana muscular (τ m) y la resistencia de entrada. Aplicación de esta técnica en modelos de ratón de la enfermedad humana puede destacar patologías fundamentales en Estados de enfermedad y ayudar a identificar estrategias de tratamiento novedosas. Por voltaje-sujeción totalmente una sola sinapsis, este método proporciona uno de los más detallados análisis de la transmisión sináptica actualmente disponible.

Introduction

Estudio de transmisión sináptica en la Unión neuromuscular proporciona penetraciones en la relación dinámica entre los sistemas nervioso y esqueléticos musculares y es un excelente modelo de examen de Fisiología sináptica. El levator auris longus (LAL) es un músculo delgado, que permite las uniones neuromusculares a visualizarse fácilmente. Informes anteriores han descrito la conveniencia de utilizar el LAL para examinar las toxinas y drogas sinápticas y han caracterizado a las características del tipo de fibra del músculo esquelético de la LAL1,2. Numerosos estudios han utilizado el LAL examinar fisiología neuromuscular3,4,5,6,7,8. De electrofisiología, la capacidad de observar fácilmente las ensambladuras neuromusculares LAL permite la colocación exacta de microelectrodos en la placa motora y reduce problemas de abrazadera de espacio en la grabación de la transmisión sináptica. Fácilmente se obtienen grabaciones de abrazadera de la corriente de las propiedades de la membrana muscular, como la constante de tiempo de la membrana (τm) y la resistencia de entrada (Res). Además, estas propiedades pueden medirse desde las fibras musculares mismo utilizadas para grabar la transmisión neuromuscular, lo que permite una comparación directa de la función sináptica a las propiedades de la membrana muscular. Análisis de estos datos puede proporcionar ideas claves en los mecanismos físicos de muchas enfermedades neuromusculares y Estados de actividad alterada.

Un aspecto clave de la técnica descrita aquí es el uso de pinza de voltaje para grabaciones sinápticas, que no están sujetos a la no-linearidad en la abrazadera de la corriente y son independientes de las propiedades de la membrana muscular. Ventajas de usar la abrazadera de tensión frente a la pinza de corriente para examinar la transmisión neuromuscular se establecieron por el pionero de los esfuerzos en la década de 19509. Debajo de la abrazadera de la corriente, EPPs que superan los 10-15 mV en amplitud no son un producto lineal del mEPP amplitud9. Por ejemplo, si el mEPP promedio es de 1 mV, un EPP de 5 mV puede ser asumido para ser el producto de 5 mEPPs (control de calidad de 5); Considerando que un EPP de 40 mV será el producto de más de 40 mEPPs. Esta no linealidad en EPPs más grandes se produce porque la conducción de la fuerza para el PPE, que es la diferencia entre el potencial de membrana y potencial de equilibrio para el receptor de acetilcolina (~ -10 mV), disminuye substancialmente durante grandes EPPs. Este problema se evita en los experimentos de fijación de voltaje porque el potencial de membrana del músculo no cambia durante los experimentos de fijación de voltaje. Un inconveniente es que experimentos de fijación de voltaje son técnicamente más difíciles de completar que la grabación de la abrazadera de la corriente. Con esto en mente, McLachlan y Martin desarrollaron una corrección matemática sencilla que representa no linealidades en grabaciones de la abrazadera de la corriente de productos ambientalmente preferibles10. Las correcciones funcionan bien11,12,13, pero lo importante es asuman que las propiedades de membrana del músculo no han sido perturbadas.

Las propiedades de membrana del músculo son especialmente importantes para considerar si estudiando las condiciones o Estados de enfermedad que alteran el músculo. Por ejemplo, el músculo esquelético del modelo transgénico R6/2 de la enfermedad de Huntington es hyperexcitable debido a una reducción progresiva en el descanso cloruro y potasio corrientes14,15. Como consecuencia, mEPPs y EPPs se amplifican en el músculo esquelético R6/2. Sin duda, otros factores pueden alterar mEPPs y EPPs. Trabajar con un modelo diferente de ratones de la enfermedad de Huntington (R6/1) encontraron cambios en los productos ambientalmente preferibles que parecen estar relacionada con proteínas SNARE8. Evaluar los mecanismos que causan alteración de la transmisión neuromuscular, sería beneficioso para eliminar los efectos de propiedades de la membrana muscular alterado mediante el uso de una abrazadera de tensión. En un estudio reciente, la transmisión neuromuscular R6/2 se estudió en ambas condiciones de abrazadera de la corriente y la tensión utilizando la técnica descrita en este documento. La totalidad de las placas de extremo motor estaban sujeta a tensión a con menos de 1% de error colocando dos microelectrodos en la constante de longitud de la placa de extremo16. Fue demostrado abrazadera de tensión y corregir registros de corriente abrazadera rindió contrastantes las mediciones de la transmisión neuromuscular en el músculo de R6/2. Esto pone de relieve que puede ser difícil corregir productos ambientalmente preferibles de no linealidad si se han alterado las propiedades de la membrana muscular y demuestra los beneficios de obtener registros de pinza de voltaje que son independientes de las propiedades de la membrana muscular. El protocolo aquí presentado es ideal para examinar las condiciones o Estados de enfermedad que afectan la transmisión sináptica y las propiedades de la membrana postsináptica.

Protocol

Animales todos los procedimientos fueron realizados según el cuidado Animal y uso Comité de Wright State University. 1. ratón eutanasia En una campana de humos, colocar el ratón en un cristal hermético anestesiar cámara. Exponga el ratón mediante la inhalación de una dosis letal de isoflurano (saturar o ~ 25%). Deje el ratón en la cámara hasta que no se observan respiración. Quite el ratón de la cámara y realizar una dislocación cervical como método…

Representative Results

La figura 8 muestra un ejemplo de los pulsos corriente (figura 8A) y las respuestas de tensión (figura 8B) de una fibra LAL debajo de la abrazadera de la corriente de un tipo de salvaje de 12 semanas de edad ratón R6/2. La presencia de mEPPs indica que estos registros fueron tomados de la placa motora. Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal. Estos registros de abrazader…

Discussion

Se describe aquí es la preparación y uso del ratón muscular LAL para la medición de la transmisión neuromuscular en condiciones de fijación de corriente o voltaje. Hay varios puntos importantes a considerar para la disección de la LAL. Limpieza excesiva del tejido conectivo de las ayudas de músculo en empalamiento del electrodo, como los electrodos puede conseguir el tejido conectivo al posicionamiento de empalamiento. Sin embargo, sólo quitar el tejido fino conectivo eso se puede quitar fácilmente para limitar…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Dr. Mark M. Rich y Daniel Miranda comentarios editoriales, Ahmad Khedraki para ayudar a establecer esta técnica y la Universidad Estatal de Wright para apoyo financiero (fondos de arranque a A.A.V.).

Materials

Olympus Compound Microscope Olympus BX51WI
10x Objective Olympus UMPLFLN10XW
40x Objective Olympus LUMPLFLN40XW
Borosilicate Glass Sutter Instruments BF150-86-7.5
CCD Camera Santa Barbara Instruments Group ST-7XMEI
Axoclamp 900A Amplifier Molecular Devices 2500‐0179  
Mater-9 Pulse Generator AMPI
Iso-flex Stimulus Isolator AMPI
pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software Molecular Devices 1-2500-0180
Concentric Bipolar Electrode FHC CBDSH75
Ball-joint Manipulator Narishige 
Non-metalic Syringes 34 Gauge World Precision Instruments MF34G-5
Nikon Stereomicroscope Nikon SMZ800N
No. 5 Forceps Fine Science Tools
Spring Scissors Fine Science Tools 15006-09
No. 2 Forceps Roboz RS-5Q41
Microdissecting Scissors Roboz RS-5912SC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 2404019862
Hair Removal Cream Nair
Grass SD9 Stimulator Grass Medical
Model P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System Molecular Devices
Low Pass Bessell Filter Warner Instrument Corp. LPF-8
Left-handed Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641/45DL
Right-handed Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641/45DR
Single Motion Controler Siskiyou Corp. MC100e
Crossed Roller Micromanipulator Siskiyou Corp. MX1641R This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller
All chemicals were orded from Fisher except,
BTS Toronto Research Chemicals B315190
CTX Alomone Labs C-270
4-Di-2-Asp Molecular Probes Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher

Referencias

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Citar este artículo
Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions. J. Vis. Exp. (135), e57482, doi:10.3791/57482 (2018).

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