在这里, 我们提出了一个健壮和优化的协议, 以生产毫克数量的本地, 无标签单体和纤维的 exon1 的杭丁顿蛋白蛋白 (Httex1) 的基础上的瞬态融合的小泛素相关修饰剂 (相扑)。
亨廷顿氏病 (hd) 是一种遗传性的致命神经退行性疾病, 由 CAG 扩张 (≥36) 在 HD 基因的第一个外显子, 导致杭丁顿蛋白蛋白 (Htt) 或 N 末端片段的表达, 其扩大 polyglutamine (polyQ) 伸展。
杭丁顿蛋白蛋白 (Httex1) 的 exon1 是最小的 Htt 片段, 它概括了细胞和动物模型中 HD 的许多特征, 是 Htt 最广泛研究的片段之一。Httex1 的小尺寸使得实验更适合使用标准和高分辨率技术与较长的碎片或全长 Htt 的生物物理特性进行比较。然而, 随着 polyQ 含量 (≥42) 的增加, 突变体 Httex1 (mHttex1) 的高聚集倾向使得开发高效的表达和纯化系统难以产生足够数量的蛋白质并使其易于科学家从不同的学科, 没有使用融合蛋白或其他策略, 改变了本机序列的蛋白质。本文提出了一种基于小泛素相关修饰剂 (相扑) 的瞬态融合技术, 对国产、无标签 Httex1 毫克量的生产进行了稳健而优化的方法。该策略的简单性和效率将消除使用非本机序列 Httex1 的需要, 从而使研究人员更容易获得这种蛋白质, 并提高了不同实验室的实验重现性。我们相信, 这些进展也将促进今后的研究, 旨在阐明 Htt 的结构功能关系, 以及开发新的诊断工具和治疗方法, 以治疗或减慢 HD 的进展。
Htt 是一种 348 kDa 蛋白, 并被牵连在几个生理功能1。当 Htt 包含一个扩展的 polyQ 区域超过36残余在它的 N 末端, 它导致 HD2,3。HD 病理特征为细胞包裹体在纹状物和皮层, 导致神经元死亡和萎缩的受影响的组织4,5。从 HD 患者死后的大脑中发现了一些含有 polyQ 重复道的 n-端 Htt 片段, 被认为是由杭丁顿蛋白蛋白6的蛋白质水解处理产生的。最近的研究表明, Httex1 也可以形成由于异常的 mRNA 剪接。Httex1 含有病理 polyQ 突变, 其在动物中的过度表达可以重述 hd7的许多关键特征, 从而突显出这个片段在 hd 病理和疾病进展6中可能发挥的核心作用, 8,9。
由于突变体 Httex1 (mHttex1) 的高聚集倾向与扩张的 polyQ, 大多数现有的表达系统是基于 Httex1 与蛋白质的瞬态融合 (如谷胱甘肽 s-转移酶 (GST), thioredoxin (TRX) 或麦芽糖结合蛋白 (MBP) 和/或多肽 (聚组氨酸) 差异改善其表达, 稳定性, 纯化和/或溶解度10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28。融合伙伴与 Httex1 链接到一个短序列, 其中包含一个蛋白酶的裂解部位, 如胰蛋白酶, 烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶或 PreScission, 以允许分裂和释放 Httex1 之前开始聚合或净化。这些方法的缺点包括可能留下额外的残余由于非无影无踪分裂和创造被截断的片断由于 miscleavage 在 Httex1 序列之内, 除了异质性由于不完全分裂 (见 Vieweg等人就这一方法的优点和局限性进行更深入的讨论)10.为了解决这些限制, 我们最近开发了一种表达式策略, 它利用Synechocystis sp的瞬态 N 终端融合, 首次启用无标记本机 Httex1 的生成。(Ssp)DnaB 蛋白质内含子到 Httex110。虽然蛋白质内含子是无影无踪和特异的 , 并产生镁数量的蛋白质 , 它仍然有两个缺点 , 可以降低产量 : 即在表达过程中可能发生的蛋白质内含子的过早裂 , 和分裂发生的事实几个小时, 这可能导致蛋白质的损失由于聚集, 特别是为 Httex1 与扩大的 polyQ 重复。
为了解决这些限制, 并完善我们的国产, 无标签 Httex1 的生产策略, 我们开发了一个新的表达系统的基础上的瞬态融合的相扑, 更确切的酵母同源 Smt3 Httex1。相扑系统在重组蛋白生产中的应用首次发表于 2004年29, 其中相扑融合蛋白的表达率和溶解度提高。相扑标记可以通过泛素, 如蛋白特异蛋白酶 1 (ULP1), 这并不需要一个识别网站, 但承认相扑的三重结构, 并实际上消除了 miscleavage30的可能性。此外 , ULP1 – mediated 是快速和无影无踪 , 并没有留下额外的残留物后面。与自催化蛋白质内含子10所观察到的融合标记的过早劈裂是由外部蛋白酶的要求完全避免的。虽然相扑战略目前广泛用于重组蛋白生产31,32,33, 我们证明, 它是特别有用的产生一个内在无序,聚集性容易, amyloidogenic 蛋白如 Httex1。我们认为, 我们的相扑融合方法的简单性、效率和鲁棒性将使来自不同学科的研究人员更容易接触到无标记的 Httex1, 并消除了在体外使用非本机序列的需要 Httex1.这是一个重要的进步, 将促进未来的研究, 以阐明结构-功能关系的 Httex1。
该协议描述了 Httex1 从细菌培养的 12 L 的纯化, 但该协议可以很容易地适应较小或更大规模的生产。该协议描述了野生型 Httex1 (wtHttex1) 的生产, polyQ 重复长度低于 (23Q) 和突变 Httex1 (mHttex1), polyQ 重复长度超过 (43Q) 致病阈值 (36Q)。
在本议定书中, 我们概述了获取含有23或43谷氨酰胺残留物的本机、未加标签 Httex1 毫克数量的有效程序。这是通过表达 Httex1 作为一个 C 终端融合到一个他的6相扑标记, 这是用来分离融合蛋白从细胞裂解物的 IMAC, 并在 HPLC 纯化之前的 Httex1。虽然相扑战略已经用于生产的其他几个蛋白质, 我们的方法表明, 独特的特性相扑也可以用来产生内在紊乱, 聚集容易, amyloidogenic 蛋白, 以前证明是极难处理和生产43,44。我们提出了一种简单、易于使用的协议, 可与生成 “行为良好” 的蛋白质的协议相媲美。相扑融合 solubilizes 和稳定 Httex1 在表达和 IMAC 净化步骤。标记的过早的分裂, 如观察与蛋白质内含子战略10和汇集不再是问题。
内在紊乱的蛋白质特别容易降解。虽然 N17 地区的 n-末端退化不是使用此协议的问题, 但截断在珠三角 Httex1 可能发生。由于截断蛋白与 Httex1 在疏水性、电荷和大小等方面非常相似, 因此用色谱法去除它们是很有挑战性的, 因此最好首先防止它们的形成。严格遵守该议定书, 总是在冰上工作, 使用足够数量的蛋白酶抑制剂, 将有助于保持观察到的截断水平非常低。在 Httex1 的 C 端应用融合标记可以很容易地去除珠三角的截断, 因为截断后的蛋白质也会失去亲和标记。但是, 如果需要维护本机序列, 则此选项不能作为 Httex1 以脯氨酸结束而应用, 而在我们最了解的情况下, 没有已知能诱导无影无踪和有效的脯氨酸后裂解的 C 终端融合标记。
该协议最关键的部分是处理的 Httex1 释放后, 相扑标记的 ULP1。蛋白质应立即通过反相色谱法纯化。幸运的是, 这是一种高效快速的反应, 通常是在4摄氏度的10-20 分钟内完成的。相比之下, 蛋白质内含子策略需要几个小时才能完全解切蛋白质内含子, 因此需要在不完全的解理和开始聚集之间进行权衡, 以最大限度地提高产量。突变 Httex1 需要快速的检查, 因为它将开始聚集在相对较高浓度存在的裂解反应, 而23Q 变种是稳定的较长的时间。在反相色谱纯化过程中, 相扑的另一优点是明显的: 当Ssp DnaB 蛋白质内含子是疏水性和强烈的柱状, 相扑是更亲水和 elutes 完全从 C4 反相柱。虽然商业 ULP1 成本相当高, 但在以前发布的协议29中, 这种蛋白质可以很容易地产生高产。
在使用 Httex1 之前应用分类协议的关键重要性是不够强调的。冻干 polyQ 蛋白如 Httex1 是稳定的, 可以储存长时间, 但不能完全溶于水和缓冲。预制寡聚物或纤维的存在对蛋白质45的聚集动力学和生物物理特性有显著的影响。此处描述的分类协议允许对蛋白质进行分类, 去除预制骨料, 并从冻干样品中生成单体 Httex1 溶液。观察了 Httex1 与蛋白质内含子的相似聚集动力学和纤维形态学。
与以前生产 Httex1 的方法相比, 这里描述的相扑策略提供了一些优势, 并扩大了可能的研究范围, 以研究这种蛋白质在健康和疾病中的结构和功能特性。SUMO-Httex1 融合蛋白易于处理, 可在常温下冷冻保存或保存在溶液中24小时, 而自由 mHttex1 会快速聚合。稳定性和高溶解度的 SUMO-Httex1 融合蛋白提供了更大的灵活性, 以操纵蛋白质和/或引入酶和化学改性到 mHttex1, 否则将无法在卵裂后。这包括引入翻译后的修改, 显影, 自旋标签, 生物素标签等.这里提出的进展应 1) 促进今后的研究, 以阐明 Httex1 的结构功能关系;2) 生成新的工具, 以调查 Htt 聚集和病理传播;3) 能够开发新的化验, 以识别稳定突变体 Httex1 的分子, 防止其聚集;4) 鼓励来自其他领域的科学家来研究这种蛋白质, 并加入我们的探索, 寻找亨廷顿病的治疗方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作的经费主要来自 CHDI 基金会和瑞士国家科学基金会的赠款。我们感谢索菲 Vieweg 博士在开发这个新的表达系统和 Lashuel 小组的其他成员时进行了有益的讨论, 以分享他们在这个表达系统中的经验以及他们的投入和宝贵的反馈。我们还感谢奥利弗 Hantschel 教授提供 ULP1 质粒。作者感谢约翰 b. 华纳博士和 Senthil 博士 Thangaraj 对手稿的批判性审查
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
Biophotometer plus | Eppendorf |