We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.
Temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest voorkomende complexe partiële epileptische syndroom en de minste inspelen op medicijnen. Diepe hersenstimulatie (DBS) is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling mislukt of Neurochirurgie wordt niet aanbevolen. Acute hersenen segmenten gekoppeld aan micro-elektrode matrices (MEA’s) vormen een waardevol instrument om te bestuderen van neuronale netwerk interacties en hun modulatie door elektrische stimulatie. In vergelijking met conventionele extracellulaire opname technieken bieden ze de toegevoegde voordelen van een groter aantal waarnemingspunten en een bekende tussen elektrode afstand, waardoor het propagatie pad en de snelheid van elektrofysiologische studeren signalen. Weefsel oxygenatie kan echter worden sterk aangetast tijdens MEA opname, waarbij een hoge perfusie-tarief, dat ten koste van verminderde signal-to-noise verhouding en hogere trillingen in de experimentele temperatuur gaat. Elektrische stimulatie verder benadrukt het hersenweefsel, waardoor het moeilijk te voeren langdurige opname/stimulatie tijdperken. Bovendien moet de elektrische modulatie van hersenactiviteit segment te richten op specifieke structuren/studierichtingen binnen het segment van de hersenen, die vereisen dat toewijzing van de elektrode worden gemakkelijk en snel live uitgevoerd tijdens het experiment. Hier, we illustreren het uitvoeren van de opname en elektrische modulatie van 4-aminopyridine (4AP)-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes met behulp van vlakke multilaterale milieuovereenkomsten. We laten zien dat het hersenweefsel verkregen muizen rat hersenweefsel overtreft en dus beter voor MEA experimenten geschikt is. Dit protocol staat garant voor de generatie en het onderhoud van een stabiel epileptiform patroon dat getrouw reproduceert het elektrofysiologische functies waargenomen met conventionele veld potentiële opname, enkele uren of langer aanhoudt en outlasts opgelopen elektrische stimulatie voor langdurige tijdperken. Weefsel levensvatbaarheid gedurende het gehele experiment is bereikt dankzij het gebruik van een kleine-volume aangepaste opname kamer waardoor laminaire flow en snelle oplossing uitwisseling zelfs op lage (1 mL/min) perfusie tarieven. Snelle MEA toewijzing voor real-time bewaking en selectie van stimulerende elektroden wordt uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI).
Epilepsie is een levensbedreigende progressieve aandoening veroorzaakt door ongecontroleerde activiteit van de hersenen1; het draagt onder de hoogste last van ziekte en belangrijke sociale stigma2,3. TLE is het meest voorkomende syndroom (40%) en de meeste vaak (~ 30%) resistent tegen anti-epileptische medicatie4. Terwijl chirurgische ablatie van de epileptogene weefsel de conditie van de patiënt verbeteren kan, het is niet haalbaar in alle patiënten en kan geen garantie voor een volledig beslag-vrij leven5. Modulatie van epileptische limbische netwerken door elektrische DBS is een veelbelovende aanpak als farmacologische behandeling of Neurochirurgie zijn niet geschikt.
Knaagdier hersenen segmenten zijn een waardevol instrument om te bestuderen hoe neuronale netwerken functie in gezondheid en ziekte6 door middel van in vitro electrofysiologie technieken, zoals ze, ten minste in deel, de oorspronkelijke architectuur en connectiviteit van de hersenen behouden regio(‘s) van belang (ROI). In het bijzonder, horizontale gecombineerde hippocampus-Entorinale cortex (hippocampus-EG) segmenten omvatten de essentiële neuronale netwerken die betrokken zijn bij TLE en in in vitro TLE onderzoek7daarom regelmatig werkzaam zijn.
Inbeslagneming-achtige activiteit kan acuut worden veroorzaakt in plakjes van de hersenen door het veranderen van de Ionische samenstelling van de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), zoals het verminderen van magnesium terwijl het verhogen van kalium8,9,10, of door middel van farmacologische manipulaties, zoals het blokkeren van remmende GABAergic activiteit (Zie11 voor een algehele herziening). Deze modellen zijn echter gebaseerd op de eenzijdige wijziging van excitatie en inhibitie; ze staan dus geen bestuderen de interactie en de gezamenlijke bijdrage van excitatory en remmende netten te ictogenesis. Continue perfusie van segmenten van de hersenen met de convulsant drug-4AP verbetert zowel de excitatory als de remmende transmissie, waardoor acute ictogenesis studeren terwijl synaptic activiteit over het algemeen intact12.
MEA’s laten opnemen van de elektrische activiteit door neuronale netwerken uit een groter aantal waarnemingspunten in vergelijking tot conventionele extracellulaire veld potentiële opname, waar ruimtelijke beperkingen beperken het aantal elektroden die kunnen worden gegenereerd ondergebracht op de hersenen segment oppervlak. Bovendien, MEA chips bieden het extra voordeel van bekende tussen elektrode afstand, die erg handig voor trace propagatie is en beoordelen van de reizende snelheid van opgenomen signalen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor opname van beschaafde neuronen13,14, worden MEA’s nu ook gebruikt te karakteriseren de elektrofysiologische kenmerken van acute hersenen segmenten knaagdieren15 en mens16verkregen. Dus, in het kader van epilepsie onderzoek, MEA’s vertegenwoordigen een waardevol instrument voor het lokaliseren van interacties van de neuronale netwerken de kern van ictogenesis16,17,18.
MEA opname draagt echter inherent technische uitdagingen in de verkrijging of het behoud van een stabiele epileptiform patroon in heel lang (enkele uren) experimentele protocollen. Eerst, weefsel oxygenatie kan niet toereikend zou zijn binnen de grote en ronde ondergedompeld-type opname kamer19,20 typische van verkrijgbare MEAs, terwijl arme signal-to-noise verhouding en temperatuur instabiliteit kunnen beïnvloeden de kwaliteit van de opname wanneer een hoge perfusie-tarief (6-10 mL/min) wordt gebruikt voor het verbeteren van de zuurstoftoevoer naar de hersenen-segment (zie bijvoorbeeld de technische opmerkingen over verwarming en perfusie apparatuur21). Tweede, terugkerende lozingen met hoogfrequente componenten, zoals epileptiform de lozingen, worden nauwelijks nageleefd bij het gebruik van ondergedompeld-type opname kamers19; Dit is met name het geval wanneer de acute epileptiform-patroon chemisch geïnduceerde is en ephaptic mechanismen omvat, zoals het geval voor de 4AP model22 (Zie11 voor een uitgebreid overzicht). Om deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers verschillende strategieën voorgesteld. Bijvoorbeeld, zijn de perfusie tarief19,20 te verhogen terwijl het verminderen van de hersenen segment dikte (≤300 µM) en gebied17,18 cruciale factoren voor het bereiken van onvoldoende zuurstoftoevoer naar het weefsel. Verbeterde hersenen segment levensvatbaarheid kan daarnaast ook worden bereikt door gebruik te maken van geperforeerde MEA’s (pMEAs), waardoor het hersenweefsel van beide zijden18zoogdierlevercellen.
Overwegende dat de beschreven aanpak aanzienlijk verbeterd de haalbaarheid van MEA opnemen vanaf de hersenen segmenten, ze zijn niet getest tegen verlengd (enkele uren) opnemen en elektrische stimulatie sessies, de laatste vertegenwoordigen een aanzienlijke stress voor het hersenweefsel. Langdurige opnamesessies kunnen worden verplicht te bestuderen van de evolutie in de tijd van de specifieke kenmerken van de epileptiform patronen die zou niet mogelijk zijn te ontmaskeren door op korte termijn metingen. In het kader van de DBS onderzoek, langdurige experimentele protocollen mogelijk moet evalueren en vergelijken van de effecten van verschillende stimulatie paradigma’s in het zelfde segment van de hersenen.
Wanneer alleen spontane elektrische activiteit worden geregistreerd moet, in kaart brengen van de elektroden met betrekking tot de ROI gebeurt meestal a posteriori, dat wil zeggen, tijdens de analyse van de gegevens; in plaats daarvan, de studie van evoked reacties of elektrische neuromodulatie paradigma’s vereist dat stimulatie worden afgeleverd aan specifieke ROI(s), de noodzaak van snelle en gemakkelijke live elektrode toewijzing tijdens het experiment te dicteren.
We illustreren hier, een eenvoudige experimentele protocol waarmee voor inductie en onderhoud van een stabiele 4AP-geïnduceerde epileptiform patroon in volwassen knaagdieren hersenen plakjes. De waargenomen activiteit weergave getrouwe van de elektrofysiologische kenmerken van dit model zoals gekenmerkt met behulp van conventionele extracellulaire electrofysiologie technieken. Het aantal uur of langer aanhoudt en outlasts aanhoudende elektrische stimulatie voor herhaalde langdurige tijdperken. De kamers gebruikt om te handhaven en uit te broeden van de segmenten van de hersenen kunnen worden gemakkelijk gemonteerd met behulp van standaard laboratorium benodigdheden (figuur 1A) Overwegende dat een aangepaste opname kamer waardoor optimale oplossing wisselkoers en laminaire flow (figuur 1B) worden verkregen uit commerciële bronnen of met behulp van 3D-printing technologie tegen een betaalbare prijs. Snelle toewijzing van de ROI(s) voor real-time bewaking en voor de selectie van stimulerende elektroden wordt mogelijk gemaakt door een aangepaste gebruikersvriendelijke GUI met de naam mapMEA, vrij beschikbaar op aanvraag.
Figuur 1: aangepaste apparatuur die wordt gebruikt voor dit protocol. (A) het bedrijf kamers voor herstel, vooraf opwarming van de aarde en pre-incubatie in 4AP worden geassembleerd met behulp van een bekerglas en een petrischaal. De petrischaal moet kleiner in diameter dan de breker en is op zijn plaats gehouden door middel van een zuiger van de spuit. De onderkant van de petrischaal wordt vervangen door een nylon gaas (van zachte kousen) gelijmd met cyanoacrylaat op de rand van de petrischaal. Zuurstof wordt geleverd via een gebogen wervelkolom naald 22 G, ingevoegd tussen de muren van de petrischaal en het bekerglas. Bubbels moeten tekenen van de kant van het bekerglas en nooit bereiken de nylon gaas om te voorkomen dat hersenen segment verplaatsing. De bovenkant van een petrischaal kan worden gebruikt als een deksel te voorkomen ACSF verdamping en handhaven van zuurstof saturatie. (B) aangepaste opname kamer. in: inlaat reservoir aan de canule verwarming en de referentie-elektrode. uit: outlet reservoir aan de zuiging naald. rec: opname kamer. (C) glas Pasteur Pipet, gekruld door brand-polijsten, gebruikt voor het behandelen van het weefsel en haar positie binnen de kamer opnemen aanpassen. (D) aangepaste segment hold-down anker. (E) de eindmontage van de opname-kamer op de MEA-chip gemonteerd. Een segment van de hersenen ligt op de bodem op zijn plaats gehouden door het anker. De rode pijl geeft de PTFE-buis die betrekking hebben op de canule Verwarming, overwegende dat de rode cirkel geeft aan de referentie-elektrode, een verzadigde KCl pellet ondergedompeld door ACSF in het inlaat-reservoir dat. De blauwe pijl geeft de zuig naald in het outlet-reservoir. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Multilaterale milieu-akkoorden zijn een instrument van onschatbare waarde voor neurofysiologie onderzoeken en rijpheid hebben bereikt in de afgelopen jaren dankzij tientallen exploratie en ontwikkeling. MEA’s bieden in vergelijking met conventionele veld potentiële opname, het grote voordeel van een hoger aantal waarnemingspunten en bekende tussen elektrode afstand, die cruciaal zijn voor het nauwkeurig lokaliseren neuronale netwerk interacties.
De MEA opname-techniek kan ook worden gekoppeld aan andere electrofysiologie benaderingen, zoals patch-clamp opname15, om te onderzoeken de relatie tussen enkel neuron en neuronale netwerkactiviteit. Bovendien kan de mogelijkheid van het visualiseren van veld potentials en multi-unit activiteit tegelijkertijd bieden waardevolle inzichten in de correlatie tussen de activiteit van kleine neuronale ensembles en collectieve neuronale netwerken. De combinatie met spanning-gevoelige kleurstoffen, calcium beeldvorming, en optogenetics29 kan afgeleid neurofysiologie fenomenen met behulp van polyedrale benaderingen. Naast farmacologische studies, de mogelijkheid van het uitvoeren van zowel opname en stimulatie met hetzelfde systeem maakt de MEA opname techniek zeer krachtig en veelzijdig: bijvoorbeeld, is het mogelijk om te bestuderen van de Synaptische plasticiteit fenomenen op de de kern van geheugen vorming30, met behulp van de protocollen van de neuromodulatie gepresenteerde, die relevant zijn voor DBS voor de behandeling van epilepsie en een breed scala aan aandoeningen van de hersenen. De recente bewijs dat de MEA opname-techniek met succes kan worden toegepast op de hersenen met epileptische weefsel16 toont zijn onschatbare waarde nut in epilepsie onderzoek, zowel om te begrijpen van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verwoestende ziekte en te fine-tunen DBS algoritmen te verbeteren het.
Echter MEAs het nastreven van electrofysiologie experimenten onder ‘limit’ voorwaarden voor segmenten van de hersenen, als gevolg van de eis van een verzonken opname-kamer en de noodzaak om de hersenen te laten dwingen snijd rust op het stevige substraat waar de micro-elektroden zijn geïntegreerd. Hersenweefsel wordt dus geen voldoende zuurstoftoevoer, die op zijn beurt kan invloed hebben op de kwaliteit van de opnamen.
Het protocol hier beschreven kan betrouwbaar opnemen en bestuderen van de ictogenesis in knaagdieren limbische netwerken gekoppeld aan multilaterale milieu-akkoorden met behulp van het model van de acute in vitro 4AP en voeren van langdurige tijdperken van de elektrische stimulatie, waarmee relevante informatie voor de evaluatie van DBS beleid.
Eerdere studies over elektrische neuromodulatie van epileptische limbische netwerken gebaseerd op het gebruik van conventionele veld potentiële opname hebt gebruikt muis of rat hersenen segmenten met soortgelijke resultaten24,–25; maar het gebruik van rat hersenweefsel bleek meer uitdagend, redelijkerwijs als gevolg van de zwakkere connectiviteit ten opzichte van hersenweefsel verkregen muizen7. Met betrekking tot de MEA techniek zijn muis hersenen segmenten geschikt op grond van hun kleiner. Bovendien, gezien het hogere tarief van voorkomen van Ictale-achtige lozingen in muis tegenover rat hersenweefsel, is het mogelijk om te testen aanzienlijk meer segmenten van de hersenen gedurende een experimentele dag, waardoor op zijn beurt verzamelen van de gegevens sneller en efficiënter, en kan het aantal gebruikte dieren te verminderen.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Ictale lozingen opgenomen met behulp van de aangepaste kamer beschreven hier lijken te zijn vergelijkbaar in duur en tarief van voorkomen die waargenomen met behulp van de conventionele MEA ring kamer en hetzelfde MEA type (planar micro-elektroden, vgl. 17). Het moet echter worden benadrukt dat hersenen segment dikte aanzienlijk moet worden verlaagd wanneer met behulp van de conventionele ronde opname kamer samen met een lage perfusie-tarief (1 mL/min), die een belemmering voor de succesvolle voortzetting van neuromodulatie vormen kan verschuldigde experimenten om slechte verbindingen.
In dit protocol biedt een laag-volume aangepaste opname kamer geïnspireerd door patch-clamp opname kamer ontwerp stabiele en betrouwbare laminaire flow die is van cruciaal belang voor de succesvolle uitoefening van MEA opnamen; het laat ook de hersenen segment dikte 400 µm verhogen met het oog op een eerlijke trade-off tussen weefsel levensvatbaarheid en intrinsieke connectiviteit. Het wordt immers erkend dat laminaire flow van de oplossing voor het opnemen in de kamer is wenselijk voor hersenen segment electrofysiologie, omdat het niet is beïnvloed door de temperatuur, zuurstof, en pH verlopen die worden waargenomen in de circulaire-flow opname ronde kamers19,20,31 (zoals degene voorzien van verkrijgbare MEA). Dergelijke verlopen voeren experimentele bias en ook schadelijk zijn voor het segment van de hersenen. Opname kamers van een relatief klein volume (~1.5 mL) samen met een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min)16,31 toestaan voor passende uitwisseling van de perfusie-medium (≥3 tijden / min). De aangepaste kamer gemakkelijk kan worden verkregen uit commerciële bronnen tegen een betaalbare prijs of geproduceerd in eigen huis met behulp van 3D-printing technologie. Andere studies hebben gemeld MEA opnames van 400 µm dik menselijk brein segmenten16 -met behulp van de conventionele MEA ring kamer, terwijl het volume van de ACSF tot 1 mL en handhaving van een hoge perfusie tarief (5-6 mL/min) met behulp van een geluidsarme peristaltische pomp. Echter, de auteurs hebben gebruikt een ander model van ictogenesis, dat wil zeggen, de lage Mg2 +, die is waarschijnlijk dat minder beïnvloed dan het 4AP-model door ephaptic mechanismen met betrekking tot aanzienlijke stijging van de concentratie van extracellulaire K+ 11 , 22. Wij hebben gevonden dat een hoog perfusie-tarief is niet wenselijk in het 4AP-model, mogelijk als gevolg van de snelle wash out van geaccumuleerde extracellulaire K+, die wellicht aanzienlijk worden verhoogd in de opname ACSF16. In feite Ictale gebeurtenissen te zien meer ‘gedeelde’ wanneer ASCF perfusie snelheid werd verhoogd tot 2-3 mL/min en de hersenen-segment was ondergedompeld door een dikke laag van de ACSF, overwegende dat volwaardige lozingen exposeren robuuste tonic-klonische onderdelen kon worden hersteld bij de terugkeer naar een lager tarief voor perfusie (1 mL/min) en een dunner ACSF laag rechts op het weefsel oppervlakte niveau (gegevens niet worden weergegeven). De zaal van de aangepaste opname in dit protocol omschreven kunt uitwisselen van het medium perfusie 3 – 5 keer / min bij een debiet van 1 mL/min. Zo is de algehele zuurstoftoevoer naar de hersenen segmenten sterk verbeterd zelfs bij relatief lage perfusie tarieven, terwijl nog het waarborgen van een stabiele temperatuur en hoge signaal-/ ruisverhouding opnemen. Bovenal is het mogelijk om te houden van de concentratie van de extracellulaire K+ op een fysiologische waarde.
Het 4AP model van ictogenesis vereist geen elke wezenlijke verandering van de Ionische samenstelling van ACSF, zoals verlaging Mg2 + of toenemende K+, en biedt het unieke voordeel om zowel de excitatory als de remmende overbrengingen intact te houden 12, een aspect dat zeer relevant is in epilepsie onderzoek in het licht van de cruciale rol van glutamaterge zowel GABAergic netwerken in epileptiform synchronisatie (Zie 7). De 4AP-ACSF gebruikt in dit protocol bevat een fysiologische K+ -concentratie (3,25 mM) en een iets lagere Mg2 + concentratie dan het bedrijf ACSF (1 mM versus 1.3 mM). Deze concentratie valt nog steeds binnen de gerapporteerde fysiologische waarden van Mg2 + concentratie in het CSF van knaagdier en het wordt gebruikt in veel laboratoria (zie bijvoorbeeld17,,18). Het doel van het protocol beschreven, hebben we gevonden dat deze lichte daling heeft de voorkeur om te helpen bij het effect van 4AP.
In vorige werk, is 4AP toegepast op het segment van de hersenen wanneer het al binnen de opname kamer17,18 geplaatst was. Tenzij de experimentator observeren van de latentie van de tijd tussen de toepassing van de 4AP en het begin van de epileptiform patronen moet, vinden wij dat deze aanpak nogal tijdrovend is en niet geschikt is om de langdurige opname en stimulatie sessies in dit protocol beschreven. Pre-incubatie van hersenen segmenten in 4AP bij 32 ° C kunt sparen veel experimentele tijd, omdat de hersenen segmenten kunnen worden vooraf behandeld in serie terwijl het nastreven van het experiment met behulp van andere weefselsecties.
De langdurige levensvatbaarheid van hersenen segmenten wellicht handig om te analyseren netwerkfuncties op de lange termijn. Bovendien is hun verbeterde veerkracht aan repetitieve elektrische stimulatie van groot voordeel als de experimentator wil vergelijken verschillende stimulatie-protocollen, die moeten worden uitgevoerd in hetzelfde segment hersenen voor statistische robuustheid. In onze handen, wanneer testprotocollen 3 stimulatie, elk voorafgegaan door een fase van de controle en gevolgd door een herstelfase, het experiment kan duren 3-5 h. In dit verband is live MEA toewijzing cruciaal om te activeren het juiste traject en onderdrukken in plaats van het voordeel van ictogenesis via elektrische stimulatie. Onze gebruikersvriendelijke GUI is een snel, eenvoudig en flexibel instrument toewijzen van de elektroden van verschillende breinstructuur. In tegenstelling tot de commerciële software kan het toevoegen van aangepaste MEA lay-outs zelfs met elementaire programmering vaardigheden. Afbeeldingen kunnen worden verworven op heldere gebied; Dus, is een algemene doel-camera die goede resolutie heeft en past op een Microscoop geschikt. Een omgekeerde Microscoop is essentieel voor het visualiseren van de microelectrodes positie ten opzichte van het segment van de hersenen, aangezien dit worden onder het weefsel verborgen zou als met behulp van een rechtop Microscoop. Een stereomicroscoop wordt echter aanbevolen naast het omgekeerde type als de experimentator uitvoeren van mes-snijdt moet verstoort of specifieke neuronale studierichtingen.
Ten slotte, een ander voordeel van de voorgestelde aanpak is de vergadering van de goedkope en relatief gemakkelijk van de meeste van de vereiste hulpmiddelen, zoals de kamer aangepaste opname en de kamers van het bedrijf, het warme bad en het segment anker, evenals het onnodige gebruik van een dure Geluidsarme peristaltische pomp.
Beperkingen van de techniek:
MEA opname niet mogelijk visualiseren van zeer langzame golven, dat wil zeggen, DC verschuivingen in het signaal. Dergelijke verleggingen basislijn kunnen helpen asymptotische meting van Ictale kwijting duur en, meest belangrijk, ze zijn fundamenteel voor het bestuderen van corticale verspreiden depressie (een verschijnsel dat betrekking heeft op plotselinge onverwachte dood in epilepsie32 en wordt gedeeld tussen epilepsie en migraine33).
Met betrekking tot elektrische neuromodulatie kunt het protocol hier beschreven verschillende stimulatie sessies uitvoeren zonder hersenen segment levensvatbaarheid. We kunnen maximaal 3 sessies van de stimulatie van 20-45 min, vergelijkbaar met wat in eerdere werk25gemeld uitvoeren. Hoewel de hersenen segmenten kunnen waarschijnlijk weerstaan een hoger aantal sessies van de stimulatie of langer stimulatie protocollen, testte wij niet hersenen segmenten in dit opzicht. Het is raadzaam om de beperking van het aantal stimulatie protocollen tot en met 3 en het vermijden van langdurige (≥60 min) stimulatie sessies, die hersenweefsel gehandhaafd onder deze limiet omstandigheden, tot het uitblijven van herstel bij stimulans geldopname aanzienlijk kunnen benadrukken.
Kritische stappen binnen het Protocol:
Verschillende kritieke factoren kunnen een belemmering vormen de succesvolle uitoefening van opname en modulatie van de epileptiform-activiteit in de hersenen segmenten gekoppeld aan MEA. Naast de knaagdiersoort gebruikt en de kwaliteit van de segmenten van de hersenen, het percentage van de perfusie tijdens opname en de dynamiek van de stroom van de ACSF (dwz., laminaire versus circulaire) binnen de opname kamer, we hebben geconstateerd dat de voorwaarden voor herstel en lange termijn onderhoud van segmenten van de hersenen alsook de wijze van toepassing van de 4AP zijn de meest kritische stappen.
Bij het gebruik van een verzonken bedrijf kamer is het van cruciaal belang voor het opslaan van de segmenten van de hersenen bij kamertemperatuur te behouden weefsel netwerk hersenactiviteit en het voordeel van de inductie van Ictale-achtige lozingen door toepassing van de 4AP. In onze handen verslechterd herstel en onderhoud bij 32 ° C het hersenweefsel binnen 3-4 uur van het snijden.
Incubatie van hersenen plakjes in 4AP-ACSF bij kamertemperatuur en opname bij 32 ° C is, echter niet wenselijk. We hebben veel problemen in het observeren van robuuste terugkerende Ictale lozingen in deze voorwaarde gevonden. Inderdaad, lage temperaturen in het bereik van 20-24 ° C hebben gemeld te temperen of zelfs te voorkomen 4AP-geïnduceerde ictogenesis beide in vitro34 es in vivo35. Dus, de 4AP-incubatie en opname-temperaturen moeten vallen binnen de 30-34 ° C en gepaard moeten gaan. Om te voorkomen dat het hersenweefsel onder teveel stress als gevolg van de gelijktijdige inductie van hyperexcitability door de 4AP en de plotselinge blootstelling van hersenen segmenten van kamertemperatuur aan de warme (32 ° C) 4AP-ACSF, is het van fundamenteel belang voor het uitvoeren van een tussenliggende vooraf opwarming van de aarde stap en laat die de hersenen segmenten koeien op het bedrijf ACSF bij 32 ° C gedurende 20-30 min. deze stap overslaan invloed kunnen zijn op de inductie ictogenesis door 4AP.
Een ander aspect dat moet worden genoemd is het belang van D-glucose-concentratie in de ACSF na het snijden. Een concentratie van 25 mM behoudt de hersenen segmenten beter dan de concentratie van de 10 mM gebruikt in veel laboratoria en het verbetert ook het tarief van voorkomen van Ictale activiteit, die 2-fold sneller (, waardoor het makkelijker om te zetten van een lange reeks van experimentele protocollen in verschillende segmenten van de hersenen elke dag).
Tot slot moeten enkele belangrijke fijne details tijdens de segmenteringshulplijnen procedure worden genoemd. Ten eerste, sta niet toe de de hersenen intact en de segmenten van de hersenen te bevriezen in de kou snijden ACSF. Koeling van de hersenen voor < 2 min volstaat gezien de kleine omvang van de hersenen van de muis. Weefselsecties moeten onmiddellijk uit de buffer lade worden overgedragen aan de spoeldouche bekers bij kamertemperatuur. Spoelen van het snijden is ACSF heel belangrijk dat anders de hoge sacharose concentratie zal maken de hersenen segmenten aan de nylon gaas van de kamer van het bedrijf vasthouden. Om effectief spoelen het weefsel, is het belangrijk om te minimaliseren van de snijden ACSF inhoud van de Pipet van de overdracht om niet vervuilen het bedrijf ACSF overdreven. De 2-traps spoelen helpt bij het minimaliseren van verontreiniging. Na voltooiing van de segmenteringshulplijnen procedure, moeten weefselsecties worden overgedragen onmiddellijk uit de spoeldouche bekers in de vergaderzaal van bedrijf, waar de zachte nylon mesh geschorste halverwege in het bedrijf ACSF weefsel oxygenatie kan aan beide zijden. Hetzelfde principe moet worden toegepast in alle stadia na de segmenteringshulplijnen procedure: hersenen segmenten moeten nooit zitten aan de onderkant van het bekerglas, ze mag niet in contact met de zijkanten van de kamers van het bedrijf, en ze moeten nooit met elkaar in contact, noch overlappen.
Wijzigingen en probleemoplossing:
ACSF samenstelling kan worden aangepast van de experimentator. Bijvoorbeeld kunnen drugs worden toegevoegd aan het ontleden van de bijdrage van bepaalde neurotransmitters of ionenkanalen om de werkzaamheid van elektrische neuromodulatie. Bovendien, pyrodruivenzuur en ascorbinezuur (Zie tabel 2) mag achterwege blijven, hoewel wij vinden dat zij een krachtige neuroprotectieve rol uitoefenen. In tabel 3 rapporteren we de meest voorkomende problemen die kunnen worden aangetroffen in dit protocol en hoe om te gaan met hen.
Conclusies:
MEA opname is ongetwijfeld een waardevolle techniek inspelen op de interactie van neuronale netwerken in gezondheid en ziekte. Naast farmacologische studies is het ook mogelijk om elektrische neuromodulatie protocollen die relevant voor DBS toegepast op epilepsie en andere neurologische aandoeningen zijn. In dit protocol, hebben we aangetoond dat het mogelijk om te reproduceren van typische periodieke stimulatie experimenten met vergelijkbare resultaten verkregen met de conventionele extracellulaire veld potentiële opname en externe elektroden te stimuleren. De toenemende beschikbaarheid van commerciële gebruiksvriendelijke apparaten en geavanceerde software-instrumenten maken de MEA opname techniek ook geschikt voor gesloten-lus stimulatie experimenten, zodat ad hoc stimulatie aan het hersenweefsel en onderzoeken van de bijdrage van de feedbackmechanismen neuronale netwerk antwoorden.
The authors have nothing to disclose.
G.P. is Marie Skłodowska-Curie Fellow gefinancierd door de Europese Unie MSCA-IF-2014 project Re.B.Us, G.A. n.660689, onder het kader-programma H2020. De GUI-mapMEA is vrij beschikbaar op verzoek aan de auteur van ilaria.colombi@iit.it.
Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
McRack | Multichannel System | Recording software | |
McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |