Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.
De geclusterde regelmatig interspaced, korte, palindromische herhalen (CRISPR)-systeem heeft zeer genoom engineering in zowel de gekweekte cellen en de levende organismen van allerlei soorten vergemakkelijkt. De CRISPR-technologie is ook onderzocht als nieuwe therapieën voor een aantal ziekten bij de mens. Proof-of-concept gegevens zijn zeer bemoedigend, zoals wordt geïllustreerd door de recente studies die aantonen dat de haalbaarheid en de werkzaamheid van gene bewerken gebaseerde therapeutische benadering voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) met behulp van een lymfkliertest model. Met name heeft intraveneuze en intraperitoneale injectie van de recombinante adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) ingeschakeld, efficiënte cardiale levering van de Staphylococcus aureus CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (SaCas9) en twee begeleiden RNAs (gRNA) als u wilt verwijderen van een genomic regio met een mutant codon in exon 23 van muis Dmd gen. Deze dezelfde benadering kan ook worden gebruikt voor knock-out de gen-of-interest en hun hartfunctie bij postnatale muizen bestuderen wanneer de gRNA is ontworpen om te richten van de codering regio van het gen. In dit protocol tonen we in detail hoe ingenieur rAAVrh.74-CRISPR-vector en hoe te bereiken hoogefficiënte cardiale levering in neonatale muizen.
De geclusterde, regelmatig interspaced, korte palindromische herhalen (CRISPR) technologie is de meest recente vooruitgang in genoom engineering en heeft een revolutie teweeggebracht in de huidige praktijk van genetica in cellen en organismen. CRISPR gebaseerde genoom bewerken maakt gebruik van een enkele gids RNA (gRNA) om een CRISPR-geassocieerde endonuclease zoals CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en Cpf1 aan de genomic DNA doel dat is een aanvulling in de juiste volgorde op de protospacer gecodeerd door de gRNA met een specifieke protospacer aangrenzende motief (PAM)1,2. De PAM is afhankelijk van de bacteriële soorten het Cas9 of Cpf1 gen. De meest gebruikte Cas9 nuclease afgeleid van Streptococcus pyogenes (SpCas9) herkent een reeks PAM NGG dat in de genomic DNA, op de doelsoort onderdeel direct stroomafwaarts van de doel-reeks schuilt. Op de doelsite, de Cas9 en Cpf1 eiwitten genereren een pauze met dubbel-strand (DSB), die vervolgens via de intrinsieke cellulaire DNA herstelmechanismes, met inbegrip van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR) trajecten3is hersteld, 4. Bij gebrek aan een DNA-sjabloon voor homologe recombinatie, wordt de DSB voornamelijk hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die in invoegingen of verwijderingen (microdeleties resulteren kan) van nucleotiden frameshift mutaties veroorzaken als de DSB in de codering ontstonden regio van een gen5,6. Dus, het CRISPR-systeem is wijd verbeid gebruikt om ingenieur verlies-van-functie mutaties in diverse cellulaire modellen en hele organismen, om te onderzoeken van de functie van een gen. Bovendien, de catalytically inactief Cas9 en Cpf1 zijn ontwikkeld om transcriptionally en epigenetically het moduleren van de expressie van doel genen7,8.
Meer recentelijk, zowel SpCas9 als SaCas9 (afgeleid van Staphylococcus aureus) zijn verpakt in recombinante adeno-associated virus (rAAV) vectoren voor postnatale gene correctie in de diermodel van ziekten bij de mens, met name, Duchenne muscular dystrophy (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD is een dodelijke X-gebonden recessieve ziekte veroorzaakt door mutaties in het DMD -gen, dat Dystrofine-eiwit16,17 codeert, die ongeveer één in 3500 mannelijke geboorten volgens pasgeboren screening18 , 19. het wordt gekenmerkt door progressieve spierzwakte en verspillen. De DMD-patiënten verliezen meestal het vermogen om te lopen tussen 10 en 12 jaar oud en sterven van de luchtwegen en/of cardiale mislukking door de leeftijd van 20-30 jaar20. Met name, cardiomyopathie ontwikkelt > 90% van de patiënten DMD en vertegenwoordigt de toonaangevende veroorzaken van de dood in DMD patiënten21,22. Hoewel Deflazacort (een anti-ontsteking drug) en Eteplirsen (een exon skipping geneeskunde voor het overslaan van de exon 51) zijn onlangs goedgekeurd voor DMD door de Food and Drug Administration (FDA)23,24, geen van deze behandelingen Corrigeer het genetische gebrek aan de genomic DNA-niveau. De MDX-muis, die een punt mutatie bij exon 23 van het Dystrofine-gen draagt, is wijd verbeid gebruikt als een DMD model25. Bovendien, we eerder aangetoond dat de expressie van functionele Dystrofine werd gerestaureerd door-frame schrapping van de genomic DNA die betrekking hebben op exons 21, 22 en 23 in de skeletspieren van mdx muizen met behulp van intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA levering9 , en in de spieren van het hart van mdx/utrophin+/- muizen met behulp van intraveneuze en intraperitoneaal levering van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA26.
In dit protocol beschrijven we in detail elke stap in de postnatale cardiale gene bewerken om te herstellen van Dystrofine in mdx/utrophin+/- muizen met behulp van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vectoren, van gRNA ontwerp tot Dystrofine analyse in de secties van de spier hart.
In dit protocol detailleren wij alle noodzakelijke stappen voor het bereiken van de in vivo cardiale gene bewerken in postnatale muizen met behulp van rAAVrh.74-gemedieerde levering van SaCas9 en twee gRNAs. Zoals eerder opgemerkt, deze benadering kan worden gebruikt om te herstellen van Dystrofine expressie in dystrophique muizen, zoals beschreven in onze werk-27, maar het kunnen ook snelle reverse genetics studies van cardiale-gerelateerde genen in muizen zonder het langdurige proces va…
The authors have nothing to disclose.
R.H. wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health grants (R01HL116546 en R01 AR064241).
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
Horse serum | Abcam | ab139501 | |
Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |