깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

Summary

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

Abstract

피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.

Introduction

인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면¹평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨²에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.

최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식³후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종⁴에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.

C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,⁵환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피⁶을 관통 하는 기능이 있다.

C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모⁷의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델⁸, Gaspari 외. 1998⁹에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장¹⁰ 및 호흡기 책자¹¹ 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.

(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,¹²치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.

여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.

Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고. 1. C. albicans 준비 문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-113, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매?…

Representative Results

깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다. 피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금…

Discussion

여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

피부 농 양 형성 C. albicans 감염¹⁵시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방?…

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998