וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה מודדים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב לאחר היפוקסיה/Reoxygenation
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של התאים לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.
Abstract
פגיעה reperfusion מתוזמן ויעיל של העורק הראשי occluded היא האסטרטגיה הטובה ביותר עבור הפחתת גודל לאוטם שריר הלב בחולים עם מקטע ST גבוהות אוטם שריר הלב. עם זאת, פגיעה reperfusion כשלעצמה יכול לגרום עוד יותר cardiomyocyte מוות, תופעה הידועה כ פגיעה reperfusion פציעה. הפתח של הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP), עם ירידה של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP) או מיטוכונדריאלי דפולריזציה, אוניברסלית מזוהה כמספר השלב הסופי של פגיעה פגיעה reperfusion, אחראי על מיטוכונדריאלי ומוות cardiomyocyte. JC-1 הוא צבע cationic lipophilic שמצטבר בתוך המיטוכונדריה בהתאם לערך של MMP. הוא MMP גבוה יותר, וככל JC-1 מצטבר בתוך המיטוכונדריה. כמויות הולכות וגדלות של JC-1 בתוך המיטוכונדריה יכולים להשתקף על-ידי שינוי פליטת קרינה פלואורסצנטית מירוק (~ 530 ננומטר) אדום (~ 590 ננומטר). לכן, ההפחתה של היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק ניתן לציין את דפולריזציה של המיטוכונדריה. כאן, אנחנו לוקחים את היתרון של JC-1 כדי למדוד MMP, או הפתח של mPTP של תאי שריר הלב האנושי לאחר היפוקסיה/reoxygenation, זוהה על ידי cytometry זרימה.
Introduction
מחלת לב כלילית היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. טיפול הבחירה עבור הפחתת איסכמי והגבלת גודל לאוטם בחולים עם ST-קטע גבוהות אוטם שריר הלב הוא בזמן ויעילים שריר הלב פגיעה reperfusion דרך הראשית התערבות כלילית מלעורית (PCI)1, 2. עם זאת, פגיעה reperfusion גורמת לנזק נוסף, אשר יכול להסביר עד 30 אחוזים של גודל לאוטם הסופי3. זה הוא טרטוריות כי הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP) אינה רק המרכזית נזק מיטוכונדריאלי ומוות תא במהלך איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R), אבל הוא גם יעד משולבות של נמצא איתות4 , 5. כמו הפתח mPTP תמיט דפולריזציה של הממברנה הפנימית מיטוכונדריאלי (MMP) פוטנציאל4, הבחנו mPTP פתיחה באמצעות ה-5, יונקות, בתו 6′-בסדר-1, 6, 3, 3′-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) וזמינותו.
וזמינותו JC-1 היא שיטה cytofluorimetric כי הוא גם איכותי וגם כמותית, זה אומתה עוד יותר על-ידי ניתוח של MMP ברמה של המיטוכונדריה יחידה6. JC-1 קיים טופס צבור, מניב אדומה תפוזים בצבע פליטה (590 ± 17.5 ננומטר) המטריצה של המיטוכונדריה עם MMP נורמלי; עם אובדן MMP, JC-1 מומר לטופס monomeric המניבה פלורסצנטיות ירוק עם פליטה של 530 ± 15 ננומטר. לכן, ירידה ברמת היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק יכול להצביע על ההפחתה של MMP במצבים כגון איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R).
בנוסף JC-1, MMP למד גם אצל קרום חדיר קטיונים lipophilic כגון Rhodamine 123 ו- 3, 3′-dihexyloxadicarbocyanine יודיד [DiOC6(3)]. עם זאת, בהשוואה לאלה שני רגשים, JC-1 הוא אמין יותר לניתוח MMP. Rhodamine 123 יש רגישות הדלה יחסית (במיוחד ב שכבתה מצב7,8) וספציפיות המסכן. התזוזה בממוצע rhodamine 123 לפעמים הוא כל כך קטן כי זה קשה עבור חוקרים או ציוד להתבונן/לזהות. חוץ מזה, בתא בודד, ישנם אתרי קישור מיטוכונדריון שונים עבור rhodamine 123, אז זה עשויה להיות פליטת קרינה פלואורסצנטית שונים9. DiOC6(3) אינו מומלץ לגילוי MMP או כפי זה מגיב ברגישות דפולריזציה של קרום פלזמה10.
לכן, כאן אנו משתמשים וזמינותו JC-1 כדי להעריך את MMP HCMs לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את MMP של תאים לאחר חשיפה H/ר זוהה על ידי assay JC-1, MMP של תאים הוא עצמאי של גורמים כגון גודל מיטוכונדריאלי, הצורה צפיפות שעשוי להשפיע על רכיב יחיד קרינה פלואורסצנטית אותות14. כתוצאה מכך, התוצאות של JC-1 assay אמינים יחסית. חוץ מזה, זה נוח, לחי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים המחקר מפתח הלאומי, פיתוח תוכנית של סין (מספר 2017YFC1700503), התכנית הלאומית למחקר בסיסי (תוכנית 973) של סין (No.2012CB518602), נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מס 81370223 ו 81573957 מס), Postgraduates’ קרן מחקר חדשניים של פקין האיגוד הרפואי המכללה (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
Referencias
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
