Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro
Summary
Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.
Abstract
L’affaticamento è un comune e debilitante che colpisce la maggior parte dei malati di cancro. Fin qui, resti di affaticamento scarsamente caratterizzati con nessuna diagnostica di test per misurare obiettivamente la gravità di questa condizione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per la valutazione della funzione mitocondriale di PBMCs raccolti dai malati di cancro affaticato. Usando un sistema compatto flux extracellulare e iniezione sequenziale di inibitori respiratori, abbiamo esaminato lo stato funzionale mitocondriale di PBMC misurando la respirazione mitocondriale basale, ricambio capacità respiratoria ed il fenotipo di energia, che descrive la via di energia preferita di rispondere allo stress. PBMCs fresco sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando standard flebotomia. L’intera analisi descritto nel presente protocollo può essere completato in meno di 4 ore senza il coinvolgimento di tecniche biochimiche complesse. Inoltre, descriviamo un metodo di normalizzazione che è necessario per ottenere dati riproducibili. La semplice procedura e normalizzazione metodi presentati consentono per raccolta di campioni ripetuti dallo stesso paziente e generazione di dati riproducibili che possono essere confrontati tra intervalli di tempo per valutare i potenziali effetti del trattamento.
Introduction
La fatica è una condizione prevalente e angosciante che ha un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti di cancro1. A questa data, la fatica di cancro rimane definita male e si basa solo su segnalazione soggettiva da pazienti2. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di identificare un test di laboratorio diagnostico facilmente adattabile per caratterizzare obiettivamente fatica in ambiente clinico3,4.
I meccanismi sottostanti multipli, compreso disfunzione di mitocondri, sono state proposte per causare affaticamento5. I mitocondri sono gli organelli di centrale elettrica, fornendo il 95% del fabbisogno energetico cellulare tramite fosforilazione ossidativa e svolgono un ruolo importante nella segnalazione del calcio, apoptosi, segnalazione immuni e regolamento di altri di eventi di segnalazione intracellulare6 . Di conseguenza, bioenergetica mitocondriale alterata e difetti nella produzione di energia possono contribuire alla fatica. Supporto di questa ipotesi, gli studi precedenti hanno osservato le mutazioni nel DNA mitocondriale in pazienti con la sindrome di stanchezza cronica7. Mentre rimane poco chiaro se l’origine patofisiologica della fatica si trova all’interno del sistema nervoso centrale o i tessuti periferici, come i muscoli scheletrici8,9, attualmente non esiste un metodo diretto per valutare con precisione disfunzione mitocondriale legata alla stanchezza in live, contenenti cellule.
Usando cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) per studiare la funzione mitocondriale offre diversi vantaggi. In primo luogo, PBMC sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando flebotomia standard e possono essere isolati rapidamente utilizzando tecniche di laboratorio di base. In secondo luogo, la raccolta del sangue è meno dilagante che raccogliendo altri tessuti quali una biopsia del muscolo. Così, i campioni di sangue possono essere raccolti dallo stesso paziente ripetutamente nel corso del tempo, che facilita la valutazione longitudinale degli effetti del trattamento. Interessante, la funzione mitocondriale in PBMCs ha sembrato essere ben correlato con Rene stato mitocondriale in un modello animale10. Inoltre, i mitocondri delle cellule immuni sono stati utilizzati come proxy per la rilevazione di cambiamenti sistemici sotto condizioni differenti di malattia11,12. I mitocondri in cellule immuni circolanti sono particolarmente sensibile ai cambiamenti nelle funzioni immuni e immuni segnalando le molecole quali le citochine13,14,15. Ad esempio, si è osservato che PBMCs da pazienti con malattie infiammatorie reumatiche acute presentano basale elevato consumo dell’ossigeno,14. Al contrario, il consumo di ossigeno è stato ridotto in PBMC isolati dai pazienti con le circostanze infiammatorie sistemiche comprese sepsi16. Nelle circostanze infiammatorie, radicali liberi prodotti dai mitocondri disfunzionali possono contribuire ulteriormente ad elevati stress ossidativo e infiammazione prolungata17. Il ruolo centrale dei mitocondri nella produzione di energia anche come stress ossidativo suggerisce l’utilità potenziale di usando la funzione mitocondriale come un proxy per lo studio della fatica in cancro pazienti 13.
Precedenti studi hanno esaminato la funzione mitocondriale utilizzate tecniche biochimiche, misura del potenziale di membrana mitocondriale o l’isolamento di popolazioni di cellule specifiche che non possono essere facilmente adattabile nella regolazione clinica5, 14,18. Negli ultimi anni, lo sviluppo di analisi di flusso extracellulare ha permesso ai ricercatori di facilmente e accuratamente esaminare i cambiamenti nel tasso di consumo di ossigeno (OCR) in risposta alle iniezioni automatizzate di inibitori respiratori19,20 , 21 , 22. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono progettata per tipi cellulari specifici e il grande formato di alto-rendimento potrebbe non essere applicabile in una regolazione clinica. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo ottimizzato per esaminare la funzione mitocondriale per uso clinico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Affaticamento in malati di cancro è una condizione debilitante che non è ben definito o caratterizzato1. Diagnosi di affaticamento si basa interamente su una relazione soggettiva e non c’è nessuna corrente standard diagnostico o trattamento per questa circostanza, in gran parte a causa di una mancanza di comprensione nella sua pathobiology2. Dei meccanismi proposti affaticamento nei pazienti oncologici, danno nella funzione mitocondriale è una delle vie più terapeutica…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è completamente supportato dalla divisione di ricerca intramurale dell’Istituto nazionale di ricerca infermieristica del NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
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