Субцеллюлярные фракционирование из свежих и замороженных образцов желудочно-кишечного тракта
Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения простой сотовой фракционирование субцеллюлярные разделение цитоплазмы и ядерных белков в человека свежие и замороженные кишечное биопсии.
Abstract
Цель настоящего Протокола заключается в фракционировать кишечных тканей человека, полученные по эндоскопии в ядерные и цитоплазматические отсеки для локализации анализа специфических белков или белковых комплексов в различных тканей государств (т.е., здоровый против болезни). Этот метод полезен для фракционирования обоих образцов свежие и замороженные кишечных тканей; Это легко доступны для всех лабораторий и не отнимает много времени.
Introduction
Белки участвуют в почти все биологические функции в клетке и любые изменения в их структуры, количества или расположение может привести к патогенным сценарий. Ткани образец фракционирование методы являются полезным подходом для снижения сложности заболевания связанные с анализа белка. Некоторые исследования используют информацию о локализации протеина или обогатить белка от конкретных клеточных отсек, так это протокол для воспроизводимых фракционирование интакт белками полезно ответить на некоторые вопросы, биологические. Определение локализация внутриклеточных белков и мониторинг их полигамное перераспределения или взаимодействий в базальной и условиях заболевания поможет определить заболевание связанные функциональные различия1,2. Таким образом этот метод призван можно воспроизвести фракционировать кишечных тканей биопсий, свежие и замороженные, на ядерные и цитоплазматические субцеллюлярные отсеков.
Кишечное биопсии образцы обычно получаются во время эндоскопические процедуры3 (рис. 1) и может эффективно использоваться для количественного определения белка или иммунопреципитации исследований. Поскольку образцы ткани из кишечного эпителия будет содержать белки, которые могут быть непосредственно вовлечены в патогенез болезни4, кишечное биопсии образцы являются весьма ценным источником для успешной идентификации конкретных кишечных заболеваний белки. Образцы хранимой замороженные, пациент тканей вместе с клинической информации являются полезными ресурсами для анализа белка, и простой и воспроизводимой пробоподготовки является ключевым вопросом для предоставления ячейки полигамное информации с использованием ограничения количества замороженных ткани5.
Есть несколько коммерчески доступные наборы для разделения фракций сотовой, но они дороже и вообще больше времени, чем протокол, представленные здесь. Протоколы, основанные на несколько шагов градиентного центрифугирования и непрерывной градиенты ранее использовались также для фракционирования различных клеточных отсеков в различных тканях6,7. Однако поддержание согласованности непрерывного градиентов часто является трудной задачей. Аналогичные протоколы, основанный на последовательном lysis мембран ранее говорилось, но они обычно требуется более двух буферов и руки на время составляет более8 .
Когда фракционирования образцы тканей, имейте в виду что ткани образцы настоящего-клеток и клеток матрица взаимодействия, которые не присутствуют в культивируемых клеток и важным при следовании белка добычу. Надлежащего разбивка между клетками и внеклеточного матрикса без ущерба для качества белка будет решающим фактором в кишечных тканей белка изоляции9. В этом протоколе ячеек и ячеек матрицы контакты сначала сломанной, выпустив клетки и позволяя буфера до отдельных ячеек. Чтобы избежать смешивания до фракционирования белков купе, разбивка контактов должны произойти, не изменяя целостность клетки или ядерной мембраны.
За счет обогащения различных протеаз в слизистой оболочке кишечника10важно контролировать деградации белка во время извлечения. Для сведения к минимуму потенциальной деградации белка, несколько ингибитор протеазы должны быть включены в буферах экстракции белка. Кроме того если выдержки будет использоваться для функциональных анализов, важно избежать денатурации белков или протеолиза, как это может привести к потере активности белков11. Для этой цели протокол выполняется при температуре 4 ° C и свежие phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) добавляется в буферы в конечной концентрации 0,1 мм перед использовать для дальнейшего подавления протеолиза.
Первым шагом в ячейке фракционирование является разрушение тканей и lysis клетки. Как упоминалось ранее, цель заключается в разбивке клетки и разрыв их открытыми с минимальным ущербом. Необходимо гомогенизированных образцов кишечных тканей, и клетки лизированы для достижения максимальной поломки мембраны клетки. В этом протоколе мы используем моторизованный толкатель смеситель сломать кишечника ткани, которая является гомогенизации в течение нескольких секунд с помощью высокой скорости vortexing действий. После гомогенизации ткани клетки инкубируют в гипотонический буфер, который будет взрыв клеточной мембраны, но будет держать ядер нетронутыми, следуют-денатурации моющего средства (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) и коротких вихревых отделить ядер от фракции цитоплазматических. После удаления цитоплазме клеточной мембраны ядер ворвались в гипертонический буфер встряхивании.
Представленные здесь используется соответствующий метод для субцеллюлярные фракционирование свежих и замороженных кишечное биопсии, которые были получены в ходе эндоскопических процедур и колеблется от 2 до 10 мг в весе. Протокол просто и воспроизводимость и может быть выполнена с использованием основного лабораторного оборудования и реагентов в соответствии с час.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для ядерные и цитоплазматические фракционирование кишечное биопсии используется протокол, описанных здесь. Очищенные белки не денатурированы и может использоваться не только в западном анализе помаркой как показано на рисунке 2 и 3 , но и в анализы, требующим р…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают помощи Ander Лопес и Мирен Telletxea видео записи и редактирования. ACR финансируется Ikerbasque стипендий и исследовательский проект от Celiacos Ассоциация де Мадрид (ACM). JRB финансируется проект ISCIII-PI16/00258 и совместное финансирование от Европейского союза ERDF/ПФ «Способ сделать Европу». Это финансируется исследовательский проект Грант 2015111068 Басков Департамента здравоохранения. IRG и Предложившем поддерживаются лектор стипендий гранты от УПВ/ЕГУ и Басков Департамента образования, соответственно.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Referencias
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
