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Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Abstract

FM de corantes são usados para estudar o ciclo da vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfifílicos têm uma cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, tornando-os solúveis em água, com a capacidade reversível, entrar e sair bilayers do lipid da membrana. Estes corantes styryl são relativamente não-fluorescente em meio aquoso, mas causa a inserção no folheto externo da membrana plasmática um > 40 X aumento da fluorescência. Nas sinapses neuronais, FM corantes são internalizados durante a endocitose SV, traficada dentro e entre pools de SV e liberada com exocitose SV, fornecendo uma ferramenta poderosa para visualizar pré-sináptica estágios da neurotransmissão. Um modelo genético primário de glutamatérgico sinapse desenvolvimento e função é a Drosophila junção neuromuscular (JNM), onde FM tingir de imagem tem sido amplamente utilizada para quantificar a dinâmica do SV em uma ampla gama de condições mutantes. O terminal sináptico Nicotínico é facilmente acessível, com uma bela matriz de boutons sinápticas grandes ideais para aplicativos de imagem. Aqui, podemos comparar e contrastar as três maneiras de estimular a drosófila MNJ dirigir atividade dependente FM1-43 tintura absorção/liberação: aplicativo 1) banho de alta [K+] para despolarizar tecidos neuromusculares, 2) nervo motor do eletrodo de sucção estimulação para despolarizar o nervo pré-sináptica terminal e 3) alvo transgénico expressão de variantes de channelrhodopsin para controle de luz-estimulada, espacial de despolarização. Cada um desses métodos tem vantagens e desvantagens para o estudo dos efeitos de mutação genética sobre o ciclo SV na drosófila MNJ. Discutiremos essas vantagens e desvantagens para ajudar a seleção da abordagem de estimulação, juntamente com as metodologias específicas para cada estratégia. Além de imagens fluorescentes, corantes de FM podem ser photoconverted aos sinais de elétron-densa visualizado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para estudar mecanismos de ciclo SV a nível ultraestrutural. Nós fornecemos as comparações de confocal e microscopia eletrônica de imagens de diferentes métodos de estimulação de Drosophila JNM, para ajudar a guiar a seleção dos futuras paradigmas experimentais.

Introduction

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas1. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas2. Essas vesículas ancorar na membrana pré-sináptica de plasma fusão local ativo zonas (AZs), onde a exocitose Medeia a liberação do neurotransmissor glutamato para trans-comunicação sináptica. Posteriormente, as SVs são recuperadas da membrana plasmática através do beijo e executar reciclagem ou endocitose mediada por Clatrina (CME) por ciclos repetidos de exo/endocitose. A Drosophila Nicotínico é facilmente acessível e adequado para isolar e caracterizar os mutantes de ciclo SV. Usando telas de genéticas para a frente, mutações romance conduziram à identificação de novos genes críticos para o ciclo SV3. Além disso, abordagens de genéticas reversos começando com genes já conhecidos conduziram para a elucidação de novos mecanismos de ciclo SV através a cuidadosa descrição do mutante ciclismo fenótipos4. A Drosophila Nicotínico é quase ideal como uma preparação experimental sináptica para dissecar os mecanismos de endocitose e exocitose SV via métodos de opticamente vesículas de pista de ciclismo durante a neurotransmissão.

Uma gama de marcadores fluorescentes permitem rastreamento visual das vesículas durante a ciclagem dinâmica, mas o mais versátil é análogos de tintura de FM que é sintetizado pela primeira vez Mao, F., et al. 5. estruturalmente, FM corantes contêm uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectado através de um anel aromático, com uma região central, conferindo Propriedades espectrais. Estes styryl corantes particionar reversível em membranas, não ‘perder um combate’ entre membrana folhetos e nunca são tão livre no citosol e são muito mais fluorescente em membranas de água5. Inserção reversível em uma bicamada lipídica provoca um 40-fold aumento na fluorescência6. Em sinapses neuronais, clássico FM tintura etiquetando as experiências consistem em banhar a preparação sináptica com o corante durante despolarizantes estimulação para carregar corante através de endocitose SV. Tintura externa é então lavada e o ciclo SV é preso em uma solução de ringer livre de cálcio a imagem carregada sinapses7. Uma segunda ronda de estimulação em um banho sem corantes provoca a liberação de FM por exocitose, um processo que pode ser seguido por medição a diminuição de intensidade de fluorescência. Populações de SV de uma única vesícula para piscinas contendo centenas de vesículas podem ser monitorada quantitativamente6,7. Corantes de FM têm sido utilizados para dissecar dependente da atividade de mobilização das piscinas SV funcionalmente distintas e para comparar beijo e executar vs CME ciclismo8,9. O método foi modificado para separadamente do ensaio evocado, espontânea e miniatura sináptica ciclo de atividades (com equipamento altamente sensível para detectar alterações de fluorescência muito pequenas e reduzir fotobranqueamento)10. Ensaios podem ser estendidos ao nível ultraestrutural por photoconverting o sinal de FM fluorescente em um rótulo de elétron-densa para transmissão microscopia eletrônica11,12,13,14 .

Historicamente, banho preparações sináptica em uma alta concentração de potássio (doravante referida como “alta [K+]”) tem sido o método de escolha para despolarizar a estimulação para induzir SV ciclismo; que vão desde o sapo colinérgico Nicotínico5, a culta neurônios hippocampal cérebro de roedor15, para a Drosophila glutamatérgico MNJ modelo16,17. Esta abordagem de [K+] alta é simples, exige nenhum equipamento especializado e, portanto, é acessível para a maioria dos laboratórios, mas tem limitações para aplicação e interpretação dos dados. Um método muito mais fisiologicamente apropriado é usar sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo4,5,12. Essa abordagem conduz a propagação do potencial de ação para estimulação direta do nervo pré-sináptica terminal, e os resultados podem ser directamente comparados a ensaios eletrofisiológicos de neurotransmissão função13,14, 15, mas requer equipamento especializado e é tecnicamente muito mais desafiador. Com o advento da optogenetics, o uso da estimulação neuronal channelrhodopsin tem vantagens adicionais, incluindo controle spatiotemporal apertado de expressão de canal usando o binário Gal4/UAS sistema20. Esta abordagem é tecnicamente muito mais fácil do que a estimulação de sucção eletrodo e requer nada mais do que uma fonte de luz LED muito barata. Aqui, nós empregamos imagem de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibrometo de piridínio) tanto a comparar e contrastar esses três métodos diferentes de estimulação para a Drosophila MNJ: alta simples [K+ ], desafiando channelrhodopsin elétricos e novas abordagens.

Protocol

1. larval cola dissecação Misture bem 10 partes de elastómero de silicone base com 1 parte de elastômero de silicone, agente do kit de elastômero (Tabela de materiais) de cura. Revestir as lamelas de vidro de 22 x 22 mm com o elastômero e cura em um prato quente em 75 ˚ c durante várias horas (até já não pegajoso ao toque). Coloque uma lamela de vidro revestido de elastômero único na câmara de dissecação de vidro plexi sob medida (Figura …

Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a tintura de FM de atividade dependente da imagem latente do protocolo. O experimento começa sempre com a mesma dissecação cola larval, independentemente do método de estimulação usado posteriormente. Figura 1a é um diagrama esquemático de uma larva dissecado, mostrando o cordão nervoso ventral (VNC), irradiando nervos e repetidas hemisegmental muscular padrão. O VNC é removid…

Discussion

Estímulo despolarizante salino de alta [K+] é de longe a mais simples das três opções para tintura de FM de atividade-dependente ciclismo, mas provavelmente o menos fisiológicas29. Este método simples depolarizes cada célula acessível em todo animal e assim não permite estudos direcionados. Pode ser possível aplicar localmente alta [K+] soro fisiológico com uma micropipeta, mas isto ainda vai despolarizar células pré/pós-sináptica e provável glia sinapse-asso…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Membros Broadie laboratório para contribuições para este artigo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01s MH096832 e MH084989 para K.B. e NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 para D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
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Referencias

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Keywords: FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
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