Summary
Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.
Abstract
Quantificazione di metilazione del DNA può essere ottenuto utilizzando del bisolfuro, che sfrutta la proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile, in un contesto di DNA single-stranded. Del bisolfuro può essere mirato (mediante PCR) o eseguite sul genoma intero e fornisce quantificazione assoluta di metilazione della citosina alla singola base-risoluzione. Data la natura distinta del DNA nucleare e mitocondriale, in particolare nella struttura secondaria, adattamenti di metodi di sequenziamento di bisolfito per indagare la metilazione della citosina nel mtDNA dovrebbero essere fatto. Struttura secondaria e terziaria di mtDNA può effettivamente portare ad bisolfito sequenziamento artefatti che conduce a falsi positivi a causa di scarso accesso denaturazione incompleta di bisolfito a DNA single-stranded. Qui, descriviamo un protocollo con una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con pipeline di analisi bioinformatica per consentire la quantificazione accurata della citosina i livelli di metilazione nel mtDNA. Inoltre, forniamo le linee guida per la progettazione il primer di sequenziamento di bisolfito specifici di mtDNA, al fine di evitare indesiderabili segmenti nucleare mitocondriale di targeting (NUMTs) inserito nel genoma nucleare.
Introduction
Il genoma mitocondriale è una struttura circolare, doppio filamento di circa 16,5 kg base (kb), che costituiscono un pesante e un filo di luce. Il genoma mitocondriale è presente in più copie all'interno di ogni cella, maternamente ereditata e codifica componenti essenziali della catena respiratoria complessi1. Simili ai genomi batterici e a differenza di genoma nucleare, il genoma mitocondriale è organizzato in numerose strutture secondarie e terziarie, come strutture a spirale e supercoiled2, che può rendere difficile l'accesso durante la sequenza esperimenti3.
Nel nucleo, metilazione del DNA è un contrassegno epigenetico estesamente studiato che svolge un ruolo in numerosi processi, in particolare nella regolazione dell'espressione genica. Nel genoma di mammiferi, metilazione del DNA avviene principalmente sulla posizione 5 dell'anello pirimidinico di deoxycytidines, per lo più su dinucleotidi CG (o CpG). Metilazione della citosina è trovata al 70% di tutti i CpG nel genoma di cellule somatiche e conti per ~ 1% del totaleche 4basi di DNA. Iperomocisteinemici del DNA è stata descritta anche in contesti non-CpG, come CpA, CpT e CpC ed esiste in varie quantità nel DNA nucleare, con valori fino al 25% di tutti i cytosines metilati in cellule staminali embrionali5,6,7.
Mentre la metilazione della citosina del genoma nucleare è ampiamente accettata, l'esistenza di metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale è ancora discutibile. Il primo studio investigativo del mtDNA metilazione è stata eseguita in cellule coltivate dove la metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata prontamente, anche se a livelli inferiori rispetto al nucleare DNA8. Nelle cellule umane e murine, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche a livelli bassi (2-5%). Usando le analisi basandosi su 5 metilcitosina cattura quali immunoprecipitazione di DNA metilato (MeDIP) seguita da PCR quantitativa, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche in vari mouse e umani e cellule linee9,10, 11,12. Usando gli anticorpi contro la 5-metilcitosina in un test ELISA o spettrometria di massa, notevoli livelli di metilazione del DNA sono stati rilevati dalle frazioni mitocondriali purificate13,14,15, 16. Tuttavia, la maggior parte dei saggi negli studi suddetti usato tecniche che non sono stati progettati per fornire una quantificazione assoluta di metilazione del DNA a singola base-risoluzione.
Analisi di metilazione del DNA quantitativa e risolutiva può avvenire mediante una tecnica denominata "bisolfito di sequenziamento", che si avvale della proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile nel DNA single-stranded contesto17 . Utilizzo del bisolfuro, una costellazione di studi ha rilevato la presenza di metilazione della citosina a vari livelli. MtDNA di metilazione della regione D-loop, il 12S o della regione 16S è stato rilevato prontamente in umano18,19,20,21,22,mouse e23 24 tessuti e cellule, tuttavia, con una variabilità intrigante, 1-20% del totale cytosines attraverso gli studi.
In confronto a questi numerosi studi, solo pochi studi, tra cui dal nostro gruppo, hanno contestato la presenza del mtDNA metilazione3,25,26,27 o messo in discussione la rilevanza biologica di livelli molto bassi di mtDNA livelli (inferiore al 2%)28. Recentemente, abbiamo segnalato l'osservazione di un artefatto del bisolfuro potenziale nel complesso mitocondriale bisolfito sequenziamento3. Abbiamo fornito la prova che la struttura secondaria del DNA mitocondriale potrebbe portare a falsi positivi in bisolfuro, sopravvalutando quindi i livelli di metilazione. Qui forniamo un protocollo per prevenire un artefatto del bisolfito-conversione del mtDNA. Questo protocollo utilizza una semplice digestione enzimatica del DNA di distruggere strutture secondarie del mtDNA e consentire l'accesso completo al bisolfito seguendo un protocollo di sequenziamento di bisolfito. Inoltre, forniamo un'accompagnamento pipeline di bioinformatica per l'analisi di bisolfuro.
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Protocol
1. trattamento degli enzimi di limitazione
- Linearizzare mtDNA trattando totale DNA umano con l'enzima di restrizione BamHI, che taglia in posizione 14258 nel DNA mitocondriale umano.
Nota: Per mouse DNA, utilizzare l'enzima di restrizione BglII in condizioni identiche come di seguito. - Per ogni campione dove la metilazione del DNA mitocondriale è di essere valutati, preparare una provetta di reazione di 0,2 mL e aggiungere il seguente miscela: 3 μg DNA genomico (quantificato dalla fluorometria), 15 µ l tampone 3, 3 μL BamHI e acqua fino a di 150 μL
- Inserire le provette in un termociclatore per 4 h a 37 ° C.
2. bisolfito conversione
- Convertire DNA BamHI-trattato con bisolfito di sodio come descritto altrove29.
- Utilizzare 200-500 ng DNA BamHI-trattato per ogni reazione di conversione a un volume totale di 20 μL. Il recupero di DNA è 50-70%.
- Eluire il DNA bisolfuro-convertito in tampone di eluizione 10 μL.
- Quantificare il DNA single-stranded dalla fluorometria.
- Optional: Memorizzare bisolfito-convertito DNA a-20 ° C prima di procedere il restante del protocollo. Per l'archiviazione a lungo termine, archiviare DNA bisolfuro-convertito a-80 ° C
3. design di bisolfito primer di sequenziamento
- Disegnare primers per bisolfuro utilizzando gli strumenti online Methprimer30 e BiSearch31,32.
Nota: Methprimer e BiSearch consentono di cercare sequenze dell'associazione iniettore su sequenze genomiche dove cytosines vengono convertiti in thymines, similmente al post-bisolfito di trattamento. - Per l'amplificazione ottima e imparziale, evitare i dinucleotidi CpG in primers e progettare la dimensione amplicone tra 100-300 bp.
- Garantire che gli iniettori progettati sono specifici per il DNA mitocondriale utilizzando la funzione di BiSearch Ricerca di Primer. Inserire i primers già progettato bisolfito convertito, barrare la casella di bisolfito e includono un genoma di riferimento e parametri PCR.
Nota: Verrà visualizzato un elenco di possibili prodotti di PCR. - Copiare la parte superiore 1-5 sequenze dell'iniettore e incollarli in un modulo d'ordine per la sintesi del oligonucleotide.
Nota: Un elenco di umani e sequenze dell'iniettore del mtDNA del mouse che è stato convalidato in laboratorio viene visualizzata nella tabella 1. - Primer di test utilizzando bisolfito convertito PCR dopo l'elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto nel passaggio 4. Testare e ottimizzare tutte le coppie di primer separatamente e garantire che la dimensione corretta amplicone appare sul gel dell'agarosi.
Nota: Se gli iniettori multiplexing sono necessari, aggiungere primer multiple ad una singola reazione di PCR e visualizzare i prodotti di PCR su elettroforesi del gel dell'agarosi o, un metodo più risolutivo come elettroforesi del gel di poliacrilammide, per distinguere i prodotti di simile dimensione.
4. bisolfito convertito PCR ed estrazione del Gel
- Per amplificare le regioni di interesse, eseguire PCR utilizzando un'avvio a caldo Taq polimerasi. Brevemente, mix 100 ng convertito DNA, 500 µ m di primer senso e antisenso, 1 µ l dei dNTP mix (10 µ m di ciascun dNTP) e della polimerasi a 7,5 U/reazione in un volume totale di 50 µ l. PCR eseguita con le seguenti condizioni: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 cicli; 10 min 72 ° C. Uso il primer o separatamente o multiplex. - Opzionale: Quando multiplazione primer, convertito uso 200 ng DNA e le seguenti condizioni in bicicletta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 cicli; 10 min 72 ° C.
Nota: La temperatura può variare a seconda della temperatura di fusione degli iniettori. - Prodotti di PCR soggetti al gel elettroforesi su agarosio al 2% a 100 volt.
- Dolce luce UV, estrarre i prodotti PCR con un bisturi e aggiungere microprovette. Non esporre i prodotti di PCR a luce UV eccessiva per evitare danni al DNA. Evitare il tempo di esposizione più di 30 s.
- Purificare i prodotti PCR con purificazione del gel come descritto in precedenza3.
- Quantificare il DNA purificato dal passaggio 4.5 utilizzando fluorometria. Procedere al passaggio 5 o archivio campioni a-20 ° C.
35 cicli; 10 min 72 ° C. Uso il primer o separatamente o multiplex.5. bisolfito di sequenziamento libreria preparazione
- Eseguire la libreria preparazione dei prodotti PCR del bisolfuro-convertito.
Optional: multisala prodotti di PCR in questa fase. - Eseguire fine-riparazione utilizzando fino a 100 ng di prodotto di PCR. Aggiungere 3 µ l fine preparazione enzima e tampone di reazione (10x) di 6,5 µ l fine riparazione al prodotto di PCR 55,5 µ l in un tubo di 0,2 mL. Posizionare e incubare la provetta in un termociclatore per 30 min a 20 ° C, seguita da 30 min a 65 ° C.
- Legare gli adattatori sequenziamento mescolando il DNA fine-riparato con 15 µ l Blunt/TA ligasi, 2,5 µ l adattatore e 1 µ l legatura enhancer. Se si utilizza < 100 prodotto di PCR di ng come input, diluire adattatore 10 volte.
- Mettere il mix (punto 5.3) in un termociclatore e incubare per 15 min a 20 ° C. Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 3 µ l utente enzima al tubo. Mescolare e collocare la provetta nel termociclatore e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
- Dimensioni selezionare il DNA adattatore-legati utilizzando perline solido fase reversibile immobilizzazione (SPRI) con diversi rapporti di perline al DNA a seconda delle dimensioni del prodotto PCR.
- Aggiungere 13,5 µ l H2O al DNA adattatore-legati da passo 5.4 e 55 µ l risospese SPRI perline. Incubare a temperatura ambiente per tubo 5 min e posto su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida, trasferire il surnatante in una provetta nuova e gettare il tubo contenente le perle.
Nota: Il surnatante contiene il DNA adattatore-legati e grandi frammenti indesiderati sono vincolati ai talloni scartati. - Aggiungere 25 µ l risospese SPRI perline al supernatante dal punto 5.6, miscelare e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e scartare il surnatante quando la soluzione è limpida.
Nota: Il supernatante scartato contiene DNA indesiderato, mentre il DNA adattatore-legati è associato a perline. - Mentre il tubo è su supporto magnetico, aggiungere 200 µ l 80% etanolo (preparata) per lavare le perle. Incubare 30 s e rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi.
- Branelli dell'aria secche per 5 min mentre il tubo è su supporto magnetico con un coperchio aperto.
- Rimuovere il tubo dal magnete, eluire il DNA in 23 µ l di tampone di eluizione e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Mettete il tubo su un supporto magnetico e quando la soluzione è limpida, trasferire 2 µ l in una piastra a 96 pozzetti PCR per l'amplificazione di pre-PCR (passo 5.14).
- Trasferire il resto circa 21 µ l ad un nuovo tubo di 0,2 mL per l'amplificazione di PCR (passo 5,17).
Nota: Assicurarsi di non trasferire tutti i branelli come perle in grado di inibire le reazioni enzimatiche di passaggi successivi. - Procedere al passo 5.14 o archivio campioni a-20 ° C.
- Eseguire l'amplificazione di pre-PCR di RT-qPCR per stimare il numero di cicli necessari per amplificare il DNA adattatore-legati. Per reazione, aggiungere quanto segue nella PCR 96 pozzetti piastra contenente 2 µ l DNA (passo 5.11): 0,4 µ l indice primer, primer PCR universale di 0,4 µ l, 7,2 µ l H2O, mix master RT-qPCR di 10 µ l.
- Posizionare la piastra in una macchina PCR in tempo reale e la piastra di soggetto alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 cicli; 5 min 65 ° C.
- Stimare il numero di cicli di amplificazione necessari per ciascun campione sottraendo un Ct-valore per il valore Ct della pre-amplificazione RT-qPCR corrispondente alla fine della fase lineare della reazione PCR.
- Amplificare il DNA adattatore-legati dal passaggio 5.12 mescolando: 21 µ l DNA, 25 mix master di µ l PCR, primer di indice 1 µ l, primer di PCR universale 1 µ l e 2 µ l H2O. In un termociclatore, soggetto ogni campione alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [Ct calcolato dal passaggio 5.16] cicli; 5 min 65 ° C.
Nota: Ricordarsi di utilizzare solo un iniettore di indice per campione per consentire per multiplexing. L'indice viene inserito durante la PCR. - Purificare le perline SPRI DNA amplificate ed eluire in 22 µ l di tampone di eluizione.
- Controllo di qualità di biblioteca di metodo gel elettroforesi o alternativa. Guardare per le dimensioni di picco libreria corretta (dimensione del prodotto PCR più adattatore).
- Stimare le dimensioni medie di base-accoppiamenti dei prodotti libreria di analisi di striscio: In avanzate impostazioni globali, fare doppio clic su "tabella" sotto analisi di striscio. Definire l'area da 100-1000 bp e fare clic su OK. Sotto Tabella Region, viene visualizzata l'area definita e libreria media dimensione (bp) è calcolata.
- Quantificare le librerie dalla fluorometria. Procedere al passaggio 6 o archivio librerie a-20 ° C.
6. sequenziamento di nuova generazione
- Calcolare la concentrazione di nM di librerie utilizzando la formula:
- Diluire le librerie per la stessa concentrazione ad esempio 2 nanometro (Scegli 4 nM, 2 nM, 1 nM, o 0.5 nM a seconda delle concentrazioni di biblioteca). Piscina tutte le librerie per ottenere un pool di 2 librerie di nM.
- Denaturare e diluire le librerie seguendo la Guida di strumento di sequenziamento. In breve: denaturare la piscina nM 2 aggiungendo 0,2 N NaOH e incubare a temperatura ambiente per 5 min, diluire la piscina denaturata a una diluizione finale del 22. Denaturare e diluire una libreria di controlli disponibile in commercio a una diluizione finale di 12:05. Ad un nuovo tubo, mescolare la piscina di 22 con libreria di controllo di 20% 12:05.
Nota: Conversione di bisolfito introduce complessità molto basso. Spike-in libreria di controllo 20% si tradurrà in una migliore qualità di sequenziamento. - Eseguire una sequenza di accoppiato-fine bp 150 utilizzando uno strumento di sequenziamento profondo.
7. calcolo analisi - i livelli di metilazione di stima
- Generazione di file. fastq (qui chiamati sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), un indice di bismark dell'intero genoma di interesse (qui in una cartella denominata bismarkIndex) e assicurarsi che la sequenza genomic di chrM è disponibile in fasta formato (qui in una cartella denominata chrM).
- Pre-elaborare letture per rimuovere schede e bias introdotto dai primer: utilizzare lo strumento Trim_galore33. Rimuovere due nucleotidi dall'estremità 5' di entrambe le letture avanti e indietro.
trim_galore - clip_R1 2--clip_R2 2 -o. / --accoppiato di trim1..--sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Allineare le letture pre-elaborate per l'intero genoma utilizzando Bismark34
Bismark - a coda di rondine - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Nota: Se viene utilizzato un altro assetto, assicurarsi che le letture che non possono essere allineate in modo univoco vengono scartate. - Estratto di legge mappatura sul cromosoma M, qui usando Samtools35
samtools ordinare -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
samtools Indice sample1_sorted.bam
Mostra samtools -u sample1_sorted.bam chrM | samtools ordinare - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Estrarre le informazioni di metilazione
bismark_methylation_extractor -p - CX - cytosine_report..--completa..--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - Utilizzare il .bedGraph, il COV o i file di CX_report.txt per un'ulteriore analisi. Utilizzare il file di sample1_chrM.CX_report.txt per la visualizzazione e il test.
- Eseguire ulteriori ritaglio nella fase pre-elaborazione, se più aree vengono interrogati e una polarizzazione di primer può essere visibile nelle trame M-bias generate durante il mapping. Fare riferimento alla documentazione di Bismark per ulteriori informazioni.
8. computational Analysis - Test delle differenze
- Assicurarsi che il file CX_report.txt contiene 7 colonne, cromosoma (qui chrM), posizione, strand, numero di letture metilate, numero di letture non metilate, contesto C e sequenza circostante, per ogni C sul cromosoma M.
- Come il CX_report copre chrM nella sua interezza, controllare il sottoinsieme per le regioni che viene amplificate.
- Utilizzare test non parametrici per le differenze tra i campioni, come il test esatto di un pescatori per singoli di C o un segno-test per un'intera regione.
Nota: Quantificazione sarà spesso vicino metilazione 0%, che è il motivo per cui assumendo normalità non è appropriato. - Allo stesso modo, per la visualizzazione, o visualizzare quantili o calcolare intervalli di confidenza della proporzione binomiale.
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Representative Results
Due punti in questo protocollo sono cruciali durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. 1) l'apertura della struttura secondaria e 2) il disegno di primer specifici del DNA mitocondriale.
Digerendo il DNA genomico umano con l'enzima di restrizione BamHI (Figura 1), la struttura di DNA mitocondriale sarà tagliata alla posizione del nucleotide 14.258 e la struttura secondaria sarà aperto.
Le eventuali alterazioni della conversione di bisolfito con una struttura secondaria del mtDNA intatto sono molto probabile a sovrastimare il tasso di unconversion di mtDNA. Del bisolfuro, il tasso di unconversion del mtDNA è stato studiato, in non digerito e digerito il DNA totale dalle cellule di muscolo scheletrico umano, alle 5 diverse regioni del genoma mitocondriale: il Loop dislocamento (D-Loop), il ribosoma di tRNA fenilalanina e 12S (tRNA - F + 12S), 16S ribosoma (16S), NADH deidrogenasi 5 (ND5) e gene di mRNA codificante di citocromo b (CYTB) (Figura 2). Tasso di unconversion ha variato da 0 - 15,1% in tutte le regioni indagate per mtDNA non digerito. Tuttavia, quando il DNA è stato digerito prima della conversione di bisolfito, il tasso di unconversion è sceso ad un massimo di 1% di tutte le regioni (Figura 3). Così, illustrando l'importanza della digestione BamHI prima della conversione di bisolfito per evitare sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale.
Contaminazione del DNA nucleare è inevitabile quando isolando il genoma mitocondriale e dal momento che quasi l'intero genoma mitocondriale è stata replicata nel genoma nucleare, ha dato origine a inserimenti nucleari del genoma mitocondriale chiamato nucleare Segmenti mitocondriale (NUMTs)36. Per garantire che i livelli di metilazione del DNA analizzati corrispondono al DNA mitocondriale e non NUMTs, è di importanza più esterno per disegnare primers specifici per il genoma mitocondriale. Nella figura 4 viene illustrato come controllare la specificità del primer e display tabella 1 umano e sequenze dell'iniettore del mtDNA del mouse.
| Nome | Sequenza | Posizione | Dimensione amplicone | Temperatura di annealing | Strand | ||
| Umano | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisenso | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisenso | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisenso | |||
| 260 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Senso | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Senso | |||
| Mouse | |||||||
| 220 | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisenso | |||
| 260 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisenso | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisenso | |||
| 260 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Senso | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Senso | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Senso | |||
Tabella 1: sequenze Primer per l'essere umano e del mouse mtDNA. Si noti che ricottura temperature di PCR primer variare a causa delle differenze nella temperatura di fusione degli iniettori.
Figura 1 : Gel elettroforesi di DNA digerito BamHI, o non digerito. Il DNA di Genomic dal muscolo scheletrico umano era non trattato o trattato con BamHI per 4h a 37° C e l'elettroforesi del gel è stato eseguito su un gel di agarosio 1.5%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Mappa del genoma mitocondriale umano. Regioni del genoma mitocondriale, studiato da bisolfuro e il sito di enzima di restrizione BamHI vengono visualizzate. Il DNA mitocondriale contiene 13 mRNAs, 2 RNA ribosomiale (rRNA) e 22 RNA di trasferimento. Abbreviazioni: PH1: pesante-strand promotore 1; PH2: pesante-strand promuovere 2; PL: promotore di luce-filo; OH: Origine di replicazione da pesanti-strand; OL: origine di replicazione da luce-strand. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : BamHI digestione prima della conversione di bisolfito riduce il tasso di unconversion di mtDNA nelle cellule di muscolo scheletrico umano. Del bisolfuro, non digerita e digerita percentuale di unconversion di DNA mitocondriale sono stati interrogati in cinque diverse regioni del genoma mitocondriale in cellule di muscolo scheletrico umano (N= 3). La piazza piena rappresenta siti CpG e la piazza aperta rappresenta siti non-CpG. I risultati sono presentati con un intervallo di min-max e un test di segno è stato utilizzato per verificare le differenze significative unconversion. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38 e-16; 16S: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) include l'origine di replicazione e promotore di filo pesante 2 tRNA - F + 12S. Questi dati sono stati pubblicati altrove 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : L'uso di Bisearch per verificare primer specificità verso il genoma mitocondriale. A) sequenze dell'iniettore bisolfito-convertiti vengono aggiunti per la funzione BiSearch cerca di Primer (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). È contrassegnare la casella di bisolfito, e viene selezionato un genoma di riferimento. B) esempio di potenziali prodotti PCR generati sulle catene di senso e antisenso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, forniamo un protocollo del bisolfuro che è specificamente progettato per interrogare la metilazione del DNA mitocondriale. Le differenze con del bisolfuro protocolli utilizzati per DNA genomico si trova nell'utilizzazione di una fase di digestione degli enzimi di limitazione preventiva e un'analisi bioinformatica sentenza fuori falsi positivi derivanti da sequenze di NUMT.
Forniamo un protocollo per evitare artefatti del bisolfuro durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. Manufatti di sequenziamento di bisolfito portando a falsi positivi erano precedentemente segnalati37. Rimozione insufficiente di proteine accessorie del DNA di proteinasi che k è stata descritta37. La denaturazione incompleta o parziale reannealing può portare a distese di conversione incompleta, possibilmente abbassando accesso di bisolfito a singolo filamento del DNA37. Il manufatto più tardi potrebbe essere in gioco nel mtDNA dove una struttura secondaria altererebbero accesso ai cytosines. Al meglio della nostra conoscenza, l'aggiunta di una fase di digestione degli enzimi di limitazione prima della conversione di bisolfito nel contesto di stimare la metilazione del DNA mitocondriale è stato segnalato in primo luogo nel 20163,28. Nelle nostre mani troppo, previa digestione con un enzima di restrizione di singolo-taglierina abbassato drammaticamente rilevamento di cytosines non convertito3,28.
Qui, forniamo una pipeline di bioinformatic analizzare i risultati del sequenziamento di bisolfito e per rilevare gli artefatti di sequenziamento di bisolfito nel contesto del bisolfuro di genoma intero mitocondriale. Questo metodo proviene dalla nostra osservazione che il mtDNA non-tasso di conversione è stato correlato inversamente con sequenziamento profondità3,28. Questa osservazione suggerisce che la struttura secondaria e terziaria anche di mtDNA altera la frammentazione del DNA mitocondriale a regioni specifiche durante la costruzione di librerie di sequenziamento e potrebbe anche compromettere l'accesso completo di bisolfito di sodio al mtDNA. Poiché la digestione con un enzima di uno-taglierina rilascia strutture secondarie e terziarie, i nostri risultati indicano che la struttura di mtDNA è una fonte di artefatto di bisolfito e convalidare i metodi descritti nel presente documento per la quantificazione della metilazione della citosina nel mtDNA.
L'inevitabile contaminazione del DNA nucleare in preparazione mitocondriale costituisce una sfida. Questo porta a contaminazione in sequenze NUMT in letture di sequenziamento, che può polarizzare stima di metilazione della citosina nel mtDNA, anche quando l'esecuzione di mirati e bisolfuro di genoma non complesso mitocondriale. Per evitare tale distorsione, il disegno di primer di sequenziamento di bisolfito unico permette di escludere la contaminazione con metilazione a NUMTs. NUMTs abbracciano determinate regioni dell'essere umano e il genoma mitocondriale del mouse con 100% di identità, e, di conseguenza, è Impossibile disegnare primers unico a determinate regioni di mtDNA. Durante l'esecuzione di bisolfuro di genoma intero mitocondriale, sequenziamento lungo letture possono facilitare la discriminazione tra mtDNA e NUMTs. Letture d'allineamento per l'intero genoma e utilizzare solo letture in modo univoco mappate il genoma mitocondriale possono ulteriormente garantiscono l'individuazione di metilazione del DNA mitocondriale.
Infine, questo protocollo può essere usato di là di genomi mitocondriali, ad esempio, in altre istanze di bisolfuro dove la struttura secondaria del DNA rappresenta una potenziale fonte di artefatto. L'associazione fra i livelli di metilazione e la profondità di sequenziamento possa essere studiato per valutare la necessità di una digestione con un enzima di restrizione prima del bisolfuro di complesse sequenze di DNA.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari di dichiarare.
Acknowledgments
La Novo Nordisk Fondazione Centro per la ricerca di base metabolica è un centro indipendente di ricerca presso l'Università di Copenaghen, parzialmente finanziato da una donazione senza restrizione della Fondazione di Novo Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
