Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop
Summary
Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.
Abstract
Zachte weefsels in het menselijk lichaam hebben meestal stijfheid in het bereik kilopascal (kPa). Dienovereenkomstig, siliconen en hydrogel flexibele substraten hebben bewezen nuttig substraten voor het kweken van cellen in een fysieke communicatie dat gedeeltelijk in vivo voorwaarden nabootst. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het karakteriseren van de Youngs moduli isotrope lineaire elastische ondergronden meestal gebruikt voor mechanobiology studies. Het protocol bestaat uit voorbereiding van een zacht siliconen substraat in een petrischaal of stijve siliconen coating van de oppervlaktelaag van de siliconen coating met fluorescerende kralen, met behulp van een millimeter-schaal bol laten inspringen van de oppervlaktelaag (door zwaartekracht), de TL imaging kralen op de ingesprongen siliconen oppervlak met behulp van een fluorescentie Microscoop, en het analyseren van de resulterende afbeeldingen als u wilt berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Koppeling van de oppervlaktelaag van het substraat met een moduli extracellulaire matrix eiwitten (naast de fluorescerende kralen) kan het siliconen substraat te gemakkelijk worden gebruikt voor de cel plating en latere studies met behulp van tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve silicone, in plaats van een petrischaaltje, als basis voor de zachte siliconen, maakt het gebruik van mechanobiology studies waarbij externe stretch. Een specifieke voordeel van dit protocol is dat een widefield fluorescentie Microscoop, die gewoonlijk beschikbaar in vele labs is, belangrijke uitrusting die nodig is voor deze procedure. We laten zien van dit protocol door het meten van de Youngs modulus van zachte siliconen substraten voor verschillende elastische moduli.
Introduction
Cellen in zachte weefsels bevinden zich in een micro-omgeving waarvan stijfheid is in kilopascal bereik1, in tegenstelling tot weefselkweek gerechten waarvan stijfheid verschillende ordes van grootte hoger is. Vroege experimenten met cellen in de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt zachte ondergronden toonde aan dat de stijfheid van het substraat beïnvloedt hoe cellen verplaatsen op, alsmede voldoen aan de extracellulaire matrix onder2,3. In feite, beïnvloedt de stijfheid van het substraat fundamenteel de cel functie4 op een wijze vergelijkbaar met doordringende biochemische signalen. Polyacrylamide gels (bekleed met extracellulaire matrix eiwitten) zijn (water-doordringt) hydrogels die intensief zijn gebruikt als cel cultuur substraten voor mechanobiology5 bestudeert. Polydimethylsiloxaan (PDMS), de meest voorkomende silicone (polysiloxaan), wijd gebruikt als een stijve siliconen met megapascal gasgroep stijfheid voor micron-schaal fabricage6. Meer recentelijk, zachte siliconen substraten met stijfheid in het meer fysiologisch relevante kilopascal bereik hebben gewerkt als cel cultuur substraten voor mechanobiology studies7,8.
Verschillende methoden zijn gebruikt voor het meten van de stijfheid van flexibele substraten, met inbegrip van atomaire kracht microscopie, macroscopische vervorming van hele monsters op zich het uitrekken, reologie en inspringen met behulp van bollen en sferisch getipt microindentors9 . Terwijl elke techniek zijn eigen voor- en nadelen heeft, is inspringen met een bol een bijzonder eenvoudige nog vrij nauwkeurige methode waarvoor alleen de toegang tot een widefield fluorescentie Microscoop. Inspringen met een metalen bol is gebruikt voor het meten van de stijfheid van de hydrogels in eerder werk3,9,10. Vroege werk dat het belang van substraat stijfheid aan cel beweging aangetoond gebruikt deze methode om te bepalen van hydrogel substraat stijfheid3. Confocale microscopie is recenter, ook gebruikt voor een elegante karakterisering10.
Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor het voorbereiden van een zacht siliconen substraat, koppeling van fluorescerende kralen (en een extracellulaire matrix eiwitten zoals collageen ik) gewoon aan de bovenste oppervlakte, imaging een inspringen sfeer en de bovenste oppervlakte met behulp van fase en fluorescentie imaging, respectievelijk, en ten slotte analyseren van de beelden om te berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Het zachte silicone substraat voorbereid op deze wijze kan gemakkelijk worden gebruikt voor tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve siliconen (in plaats van een petrischaal) als basis voor de zachte siliconen kan ook mechanobiology studies met een externe stretch. Gerechtvaardigde klachten zijn ook praktische overwegingen nodig voor het vermijden van mogelijke complicaties aangegeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de bol inspringing methode eenvoudig is te implementeren, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de keuze van de indentor en de dikte van het monster van de siliconen. De vergelijking voor de berekening van de Youngs modulus is geldig onder een aantal voorwaarden11en deze meestal wordt voldaan wanneer de dikte van het monster silicone > 10% van de indentor-straal is en < ~ 13 x de straal van de indentor. We vonden dat een siliconen dikte van 5-10 x de straal van de indentor een goede …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Margaret Gardel voor royaal waardoor het gebruik van de rheometer. Wij erkennen de steun van de NIH (1R15GM116082), die dit werk ingeschakeld.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
Referencias
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
