Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans
Summary
Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.
Abstract
Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.
Introduction
Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteração do metabolismo secundário é um fenômeno interessante na qual glicólise é usado predominantemente para produção de energia e aeróbia respiração mitocondrial, que envolve o ciclo TCA e cadeia de transporte de elétrons, é ativador em mamíferos câncer células1,2. Nós mostramos recentemente que os níveis de lactato e a relação lactato/piruvato consequente (L/P) diminuiu durante o envelhecimento no organismo modelo Caenorhabditis elegans (c. elegans). Da mesma forma, achamos que os mamíferos tumor supressor p53 ortholog CEP-1 em c. elegans tem um papel importante nas alterações relacionadas com a idade do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais3.
Em ensaios biológicos, tais como a medição das concentrações de lactato e piruvato em células, a sensibilidade, precisão, tamanho da amostra e tempo de incubação de kits de ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram dramaticamente. Devido às inovações tecnológicas, agora somos capazes de analisar vários metabólitos e metabólitos intermediários sem a cultura em grande escala de c. elegans, que é difícil, dado o seu pequeno tamanho. Em geral, a sensibilidade de um ensaio colorimétrico é uma ordem de magnitude menor do que um ensaio fluorimétrica; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais adequada na configuração dos laboratórios comuns. Além disso, uma técnica de extração contendo precipitação de homogeneização e proteína é crucial para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato de células de c. elegans , porque este nematódeo é encerrado em um exoesqueleto chamado a cutícula, ao contrário de células de mamíferos cultivadas linhas4,5. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar as concentrações de lactato e piruvato usando kits de ensaio colorimetric comercial, incluindo dicas para extração de amostra de c. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
Referencias
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