Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt
Summary
Weißen Fettgewebe (WAT) hat kritische Mängel in seiner aktuellen Primärkultur Modelle, pharmakologischen Entwicklung und metabolische Studien zu behindern. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine adipöse Microphysiological System durch sandwichartig WAT zwischen den Blättern der Stromazellen Zellen zu produzieren. Diese Konstruktion bietet eine stabile und flexible Plattform für WAT Primärkultur.
Abstract
Weißen Fettgewebe (WAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gesundheit Gewicht und jeden Tag. Dennoch gibt es erhebliche Einschränkungen verfügbar Primärkultur Modelle, die versäumt haben, treu der adipösen Mikroumgebung rekapitulieren oder WAT Lebensfähigkeit über zwei Wochen hinaus zu verlängern. Das Fehlen eines verlässlichen Primärkultur Modells behindert stark Forschung in WAT Stoffwechsel und Arzneimittelentwicklung. Zu diesem Zweck haben wir NIH Normen eines Microphysiologic-Systems zur Entwicklung einer neuartigen Plattform für WAT Primärkultur genannt “SWAT” (Sandwich weißen Fettgewebe) genutzt. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch sandwiching Hackfleisch / WAT Cluster zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen. In diesem Konstrukt sind WAT Proben tragfähige über acht Wochen in der Kultur. SWAT unterhält die intakte ECM, Zell-Zell Kontakte und physischen Druck der in Vivo WAT Bedingungen; Darüber hinaus unterhält SWAT eine robuste transkriptionelle Profil, Sensibilität für exogene chemische Signal- und ganze Gewebefunktion. SWAT stellt eine einfache, reproduzierbare und effektive Methode der adipösen Primärkultur. Möglicherweise ist es eine breit anwendbar Plattform für Forschung im WAT-Physiologie, Pathophysiologie, Stoffwechsel und pharmazeutischen Entwicklung.
Introduction
Fettgewebe ist das primäre Organ von Fettleibigkeit, die direkte jährlichen medizinische Kosten zwischen $ 147 Milliarden und $ 210 Milliarden in die US-1trägt. Die Ansammlung von Fettgewebe trägt auch zu anderen führenden Todesursachen wie Herz-Kreislauferkrankungen, Diabetes Typ II und bestimmte Arten von Krebs2. In-vitro- Kultur-Modelle sind essentiell für metabolische Studien und Entwicklung von Medikamenten, aber aktueller Forschungsmodelle von Fettgewebe haben erhebliche Mängel. Adipozyten sind zerbrechlich, lebhaft und unheilbar differenzierte Zellen, die Zelle Kultur Kunststoffe nicht halten, und daher können nicht gezüchtet werden mit konventionellen Zelle Kulturmethoden. Seit den 1970er Jahren wurden mehrere Methoden Versuche zur Überwindung dieser Hindernisse, einschließlich der Verwendung von extrazellulären Matrizen3,4,5, , Glasdeckgläser, Decke Kultur und SUSPENSIONSKULTUR 6 , 7. jedoch diese Methoden durch Zelltod und Entdifferenzierung markiert wurden, und sie sind in der Regel für nicht mehr als einen zweiwöchigen Studienaufenthalt verwendet. Darüber hinaus versuchen diese Modelle nicht die native adipösen Mikroumgebung zu rekapitulieren, wie sie nicht intakte ECM pflegen, die Interaktionen zwischen Adipozyten und Stromazellen Zellen unterstützen, noch die kontraktilen Kräften Zellen auf einander in in-vivo ausüben WAT.
In Ermangelung einer adipösen Primärkultur Goldstandard Methode hat adipösen Forschung in erster Linie auf differenzierte Pre Adipozyten (DiffAds) verlassen. DiffAds sind multilocular, Anhänger und metabolisch aktiv. Im Gegensatz dazu primäre weiße Fettzellen sind unilokuläre, nonadherent und relativ niedrigen Stoffwechsel zu demonstrieren. Das Versagen der aktuellen adipösen Kultur Modelle zu rekapitulieren die Physiologie des gesunden Reifen Fettgewebe ist wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der Abwesenheit von FDA-zugelassene Medikamente, die Fettzellen gezielt ansprechen. In der Tat ist das Fehlen der physiologischen in-vitro- Orgel-Modelle ein großes Problem in den meisten Organen und Krankheiten.
In seiner Positionspapier über die Erstellung des Programms Microphysiological Systeme (MPS) berichtet der National Institute of Health (NIH), dass die 2013 Erfolgsquote über alle klinischen Studien am Menschen pharmazeutischen nur 18 % für Phase II und Phase III 50 war % klinische Studien-8. Das MPS-Programm soll die Unfähigkeit der in-vitro- Monokultur, Modell Humanphysiologie direkt anzusprechen. Die NIH definiert MPSs als Kultur-Systeme bestehend aus menschlichen Grund- oder Stammzellen in mehrzelligen 3D Konstrukte, die Orgel funktionieren rekapitulieren. Im Gegensatz zu reduktionistische Modelle von homogenen, verewigt Zellkulturen sollten MPSs genau modellieren, Zell-Zell, Droge-Zelle, Medikamenten und Orgel-medikamentöse Interaktionen9. Im Gegensatz zu kurzfristigen Primärkultur Methoden diktieren NIH Standards MPS Nachhaltigkeit mehr als 4 Wochen in Kultur8. Weitere Einzelheiten zu den MPS-Programm finden Sie auf der NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
Haben wir einen einfachen, Roman, anpassungsfähig, und preiswerte adipösen MPS bezeichnet “weißen Fettgewebe eingeklemmt” (SWAT)11. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch “sandwichartig” Hackfleisch / primäre Fettgewebe zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen (ADSCs) (Abbildung 1). Die daraus resultierenden 3D Konstrukt rekapituliert der Zell-Zell-Kontakt und der native adipösen Mikroumgebung von umliegenden Reifen Adipozyten mit einer natürlichen Adipocyte Unterstützung Zellpopulation. SWAT ist durch den Nachweis von 8 Wochen Lebensfähigkeit, Reaktion auf exogene Signalisierung, Adipokine Sekretion und Engraftment in einem Tiermodell validiert worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von ADSCs zu Sandwich menschlichen weißen Fettgewebe; menschlichen ADSC-Zell-Linien können über gut etablierte Protokolle15isoliert werden. Jedoch kann das System für individuelle Forschungsanforderungen (z. B. mit 3T3L-1-Zellen, Sandwich Maus WAT) angepasst werden. Dieser Prozess beinhaltet Umgang mit primären menschlichen Gewebes. Standard-Sicherheitsvorkehrungen sollten eingesetzt werden; menschliche Gewebe als BSL-2 Krankheitserreger (z. B. </em…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten bestätigen die institutionelle Unterstützung durch LSU Health Sciences Center, die das Projekt finanziert.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
Referencias
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
