在这里, 我们描述了一个优化的, Langendorff 的程序, 从一个大鼠模型的代谢综合征心力衰竭与保存的弹射分数分离的单细胞心房心肌细胞。对心脏腔腔内压进行人工调节, 以产生功能完整的心肌细胞, 适合于励磁收缩耦合研究。
在本文中, 我们描述了一个优化的, Langendorff 的程序, 以隔离的大鼠代谢综合征 (飞机状态) 的模型, 与保存的射血分数 (HFpEF) 的一个人心肌细胞。随着心房重塑是死亡率的独立预测因子, 与心房重塑和心房颤动相关的心房心肌与 HFpEF 的发病率呈上升趋势。孤立单细胞心肌细胞的研究经常被用来证实和补充体内的发现。循环血管 rarefication 和间质组织纤维化是一个潜在的限制因素, 成功的单细胞分离飞机状态从动物模型的这种疾病。
我们通过使用一种能够在隔离过程中手动调节心脏腔腔内压力的装置来解决这个问题, 大大提高形态学和功能完整的飞机状态的产量。所获得的细胞可用于各种不同的实验, 如细胞培养和功能性钙成像 (即励磁收缩耦合)。
我们为研究员提供一步一步的协议, 一个优化的解决方案列表, 详细的说明准备必要的设备, 和全面的故障排除指南。虽然最初的实施程序可能是相当困难的, 一个成功的适应将使读者能够执行最先进的隔离在大鼠模型中与 HFpEF 有关的广泛的实验。
大都会描述了糖尿病 type-2 和心血管疾病的一系列危险因素, 包括增加的动脉血压, 血脂异常 (升高甘油三酯和降低高密度脂蛋白胆固醇), 增加禁食葡萄糖和中央肥胖症1。据估计, 世界大都会的流行率为 25–30%, 持续上升2。HFpEF 是一种异质临床综合征, 常与大都会相关。HFpEF 和前阶段 (即高血压性心脏病) 的心脏重塑也伴随着心房3的重塑。左心房的收缩功能和结构改变与死亡率增加、心房颤动和新发心力衰竭4有关。心房重塑的特点是离子通道功能的变化, 钙2 +稳态, 心房结构, 成纤维细胞活化, 组织纤维化5。与 HFpEF 相关的左心房重塑及其潜在的病理机制尚不清楚, 需要进一步深入调查。动物模型已被证明是一个宝贵的工具, 并导致在心房心肌6,7,8,9领域的许多进展。
孤立单细胞心肌细胞的研究经常被用来证实和补充体内的发现。一个孤立和潜在的后续细胞培养, 允许调查信号通路, 离子通道电流, 和励磁收缩耦合。在生理条件下, 心肌细胞不会增殖。在转基因小鼠中, 心房钠素转录调控序列与猿猴病毒40大 T 抗原的融合导致了第一个永生化的飞机状态, 命名为 AT-110。AT-1 细胞的进一步发育引起了 HL-1 细胞的形成, 它不仅可以连续传代, 而且能自发收缩11。然而, 与新近分离的细胞相比, 它们表现出结构和功能上的差异, 如组织超微结构、发育肌原纤维11的高发生率和极化活化的内电流12。大鼠和小鼠心室心肌细胞 (VCM) 的分离是建立在13、14、15、16、17、18,19. 一般情况下, 切除心脏被安装到一个 Langendorff 设备和 retrogradely 灌注与一个 Ca2 +自由缓冲含有消化酶, 如胶原酶和蛋白酶。然后以逐步的方式将钙重新引入到生理条件中。然而, 即使专门用于隔离飞机状态的协议20、21, 由于纤维化和压力相关的差异, 它们在心房重塑的疾病模型中的效用是有限的。
在这篇文章中, 我们已经实施了一个协议, 以隔离的动物, 显示心房重塑 (特别是为 ZFS1大鼠模型 HFpEF)22的心房单细胞心肌细胞。现有的隔离协议得到了优化, 并辅以一个简单的, 定制的装置来控制和修改心脏腔腔内压力, 导致更高的形态和功能完整的心肌细胞的产量。下面的协议为研究员提供了一步一步的指南, 详细描述了定制的设备, 一个解决方案列表, 以及一个全面的故障排除指南。
在这里, 我们首先描述了一个协议, 从大鼠模型中分离出的单细胞飞机状态, 显示显着心房重塑22。这一过程具有独特的挑战性, 因为过量的脂肪组织可以使手术准备, 以及主动脉插管, 越来越困难。表 2中提供的故障排除指南解决了隔离过程中最常见的问题。
问题 | …
DivulgacionesThe authors have nothing to disclose. Acknowledgements这项研究得到了 DZHK (德国心血管研究中心)、EKFS (Kröner 费森尤斯基金会、卡尔亨利) 和 BMBF (德国教育部和研究部) 的支持, 以及波黑-Charité临床科学家项目资助由 Charité-Universitätsmedizin 柏林和柏林健康学院 (卡尔亨利)。 Materials
Referencias
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Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., Heinzel, F. R., Hohendanner, F. Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction. J. Vis. Exp. (137), e57953, doi:10.3791/57953 (2018).
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