Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II
Summary
Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.
Abstract
Globali difetti nella trascrizione del RNA polimerasi II potrebbero essere trascurati dagli studi di trascrittomica analizzando RNA allo steady-state. Infatti, la diminuzione globale nella sintesi del mRNA è stata indicata per essere compensata da una diminuzione simultanea nella degradazione di mRNA per ripristinare i livelli normali di stato stazionario. Quindi, la quantificazione del genoma di sintesi di mRNA, indipendentemente dalla degradazione del mRNA, è il miglior riflesso diretto dell’attività trascrizionale di RNA polimerasi II. Discutiamo qui, un metodo che utilizza non perturbante metabolica etichettatura degli RNA nascente in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In particolare, le cellule sono coltivate per 6 min con un uracile analogico, 4-tiouracile e il RNAs recentemente trascritto con etichettato è purificato e quantificato per determinare i tassi di sintesi di tutti i singoli mRNA. Inoltre, utilizzando etichettati Schizosaccharomyces pombe cellule come standard interno permette di confrontare la sintesi di mRNA in diversi S. cerevisiae ceppi. Usando questo protocollo e montaggio i dati con un modello cinetico dinamico, i corrispondenti tassi di decadimento di mRNA possono essere determinati.
Introduction
Le cellule rispondono a stimoli endogeni ed esogeni, attraverso l’alterazione dinamica del loro programma di espressione genica. Negli ultimi anni, un enorme sviluppo di metodologie di genoma permette la descrizione precisa e completa delle modifiche del trascrittoma in condizioni diverse. Nella maggior parte degli studi di transcrittomica, sequenziamento di ibridazione o ad alta velocità di microarray vengono utilizzati per quantificare i livelli di RNA da una frazione di RNA totale allo steady-state. Modifiche trascrizionali sotto una perturbazione specifica possono visualizzare una vasta gamma di risultati possibili, con un ampio spettro di geni essere up – o downregulated o cambiamenti di espressione genica specifica. Espressione genica è il risultato di un equilibrio fine-tuned — o allo steady-state — tra sintesi di RNA da RNA polimerasi e altri processi che interessano i livelli del RNA. Trascrizione di RNA polimerasi II, tra cui le tre fasi distinte (iniziazione, allungamento e terminazione), è altamente e intrinsecamente connesso all’elaborazione mRNA, esportazione citoplasmico, traduzione e degradazione.
Parecchi studi recenti hanno dimostrato che il decadimento e la sintesi di mRNA sono accoppiati meccanismi e ha mostrato che trascrizionali effetti al momento della mutazione o sotto stimoli possono essere trascurati nel quantificare il RNA totale allo steady-state. In primo luogo, il rilevamento delle modifiche trascrizionale attraverso l’analisi dei livelli allo stato stazionario di mRNA sempre dipende dal mRNA Half-Life. Una volta che la perturbazione è stato introdotto, i livelli allo stato stazionario di mRNA con emivita lunga ne risentirà molto meno rispetto a quelli dei mRNAs con breve emivita. Di conseguenza, la rilevabilità dei cambiamenti nella sintesi del RNA è fortemente sbilanciata in favore di trascrizioni di breve durate, mentre l’analisi di specie più longevo di mRNA potrebbe non riuscire a rivelare i cambiamenti dinamici nel tasso di trascrizione. In secondo luogo, diversi studi hanno dimostrato che, sia nel lievito e mammiferi, cambiamenti globali nella trascrizione potrebbero essere trascurati quando si analizzano i livelli allo stato stazionario di mRNA. Ciò è probabilmente dovuto i meccanismi che collegano mRNA sintesi e degradazione conseguente mRNA buffering. Questo ha spinto lo sviluppo di nuovi protocolli per quantificare la sintesi di mRNA disinserita dal degrado, attraverso l’analisi del mRNA appena trascritto. Negli ultimi anni, sono state presentate diverse alternative, tra cui sequenziamento eseguire-sulle globale (GRO-seq)1e trascrizione di allungamento nativo sequenziamento (NET-seq)2,3. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato inizialmente in cellule di mammifero4,5,6 e poi adattato al lievito7,8,9,10, 11, che si basa sul RNA etichettatura con un chitosani nucleosidici o base analogica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracile (4tU), rispettivamente.
Questo metodo in particolare purifica recentemente trascritto RNA dalle cellule nel quale RNA sono impulsi-etichettati con 4sU pressoché senza interferenze nell’omeostasi cellulare. Quindi, una volta che le cellule sono esposte alle 4sU, la molecola è rapidamente uptaken, fosforilato a 4sU-trifosfato e incorporata nel RNA viene trascritto. Una volta impulso-etichetta, è possibile estrarre RNA cellulare totale (corrispondenti ai livelli allo stato stazionario di RNA), e, successivamente, la frazione di RNA 4sU-labeled è tiolo-specificamente modificato, portando alla formazione di un legame disolfuro tra biotina e la recentemente trascritto RNA4,5. Tuttavia, 4sU può solo essere uptaken dalle cellule che esprimono un trasportatore nucleosidico, come il trasportatore umano dei nucleosidi (hENT1), impedendo l’uso immediato in lievito germogliante o fissione. Mentre si potrebbe esprimere hENT1 in S. pombe o S. cerevisiae, un approccio più semplice può essere raggiunto utilizzando la 4tU base modificate, poiché le cellule di lievito possono prendere 4tU, senza la necessità di espressione di un nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. infatti, il metabolismo di 4tU richiede l’attività dell’enzima uracile fosforibosiltransferasi (UPRT). In diversi organismi, tra cui il lievito ma non mammiferi, UPRT è essenziale per una via di salvataggio delle pirimidine, uracile a uridina monofosfato di riciclaggio.
Un bias importante negli studi di trascrittomica può essere introdotto tramite la normalizzazione tra diversi campioni analizzati in parallelo. Infatti, molti fattori di deviazione possono influenzare l’analisi comparativa del trascrittoma del mutante e del selvaggio-tipo ceppi: l’efficienza di lisi cellulare, differenze di estrazione e recupero di RNA e di variazioni nella calibrazione dello scanner per microarray analisi , tra gli altri. Come discusso in precedenza, tali variazioni possono essere particolarmente ingannevole quando si prevedono effetti globali sulla trascrizione del RNA polimerasi II. Un mezzo elegante da comparare con precisione i tassi di sintesi di mRNA tra diversi campioni è stato progettato utilizzando il lievito di fissione lontanamente correlate Schizosaccharomyces pombe come standard interno. Per questo, un numero fisso di etichettato S. pombe celle viene aggiunto ai campioni S. cerevisiae , cellule wild type o mutanti, prima della lisi cellulare e RNA estrazione10. Successivamente, RNA sia stazionario e recentemente sintetizzato da S. pombe e S. cerevisiae è quantificati mediante RT-qPCR o tramite l’uso di chip di microarray o sequenziamento ad alta velocità10. Combinando questi dati con la modellistica cinetica, assoluti tassi di sintesi di mRNA e di decadimento in lievito possono essere misurati.
Nel quadro di questo manoscritto, vi mostreremo come l’analisi di RNA trascritto recentemente permesso di rivelare un ruolo globale per i complessi di coactivator SAGA e TFIID nella trascrizione del RNA polimerasi II nel germogliamento lievito14,15, 16. D’importanza, gli studi passati quantificati i livelli di mRNA di stato stazionario in S. cerevisiae e suggerito che SAGA svolge una funzione predominante su un insieme limitato di geni di lievito che sono fortemente interessati dalle mutazioni nella SAGA, ma relativamente resistente agli TFIID le mutazioni17,18,19. Sorprendentemente, l’attività enzimatica di SAGA sono stati indicati per agire sul genoma intero trascritto, suggerendo un ruolo più ampio per questo co-attivatore di trascrizione del RNA polimerasi II. In diminuzione assunzione di II della polimerasi RNA in geni espressi in più è stata osservata dopo l’inattivazione della SAGA o TFIID, suggerendo che questi coattivatori lavorano insieme alla maggior parte dei geni. Quindi, la quantificazione degli mRNA appena trascritto ha rivelato che sono richiesti per la trascrizione di quasi tutti i geni di RNA polimerasi II14,15,16SAGA e TFIID. L’implementazione di meccanismi di compensazione emerge come un modo per le celle ad affrontare una globale diminuzione nella sintesi di mRNA che è tamponata da una simultanea diminuzione globale nella degradazione di mRNA. La SAGA aggiunge all’elenco di elementi che hanno un effetto globale sulla trascrizione del RNA polimerasi II, ad esempio RNA Pol II subunità10, il Mediatore coactivator complesso20, il generale trascrizione fattore TFIIH21,22 e indirettamente, elementi del mRNA degradazione macchine9,10,23. Tali eventi compensativi universalmente sono stati osservati nei mutanti di SAGA, contabilità per il modeste e limitate le modifiche nei livelli di mRNA di stazionario nonostante una diminuzione globale e severa nel mRNA sintesi14. Simili analisi sono state eseguite anche in un ceppo di eliminazione BRE1 , con conseguente perdita completa dell’istone H2B ubiquitinazione. Interessante, un molto più lieve ma costante globale effetto sulla trascrizione del RNA polimerasi II potrebbe essere rilevato in assenza di Bre1, che indica che etichettatura metabolica di RNA recentemente trascritto nel lievito può rilevare e quantificare una vasta gamma di cambiamenti in mRNA tassi di sintesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre per analizzare i cambiamenti nella trascrizione del genoma strumenti ancora stanno migliorando, l’esclusiva analisi del trascrittoma attraverso la quantificazione dei livelli allo stato stazionario di RNA potrebbe non riflettere accuratamente le modifiche nell’attività di RNA polimerasi II. Infatti, i livelli di mRNA sono regolati non solo dalla sintesi di RNA, ma anche dalla loro maturazione e degradazione. Per misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione di mRNA, distinti protocolli sono stati svi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Laszlo Tora per il suo sostegno e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Santoliquido per le loro discussioni. T.B. è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e l’arco di Fondation. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Questo studio è stato supportato anche da ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo di stato francese gestito dall’Agence Nationale de la Recherche sotto il telaio programma Investissements d’Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
Referencias
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
- Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
- Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
- Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
- Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
- Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
- Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
- Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
- Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
- Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
- Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
- Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
- Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
- Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
- Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
- Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
- Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
- Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
- Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
- Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
- Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
- Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
- Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
- Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
- Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
- Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
