シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量
Summary
ここでは、定量的阻害吸光光度法によるシアノ バクテリアのフィコビリタンパク質の内容を決定するためのプロトコルを提案する.抽出手順でした; 他のシアノ バクテリアや藻類の系統に適用も正常にただし、色素の吸収スペクトルの違いは、各緊張に吸光光度式を個別にテストする必要が。
Abstract
モデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量のための単純なプロトコルです。フィコビリタンパク質は、フィコビリソーム、シアノ バクテリアにおける主要集光性アンテナの最も重要なコンポーネントといくつかの藻類の分類群。阻害のフィコビリソームを含む 2 つのフィコビリタンパク質: フィコシアニン、アロフィコシアニン。このプロトコルでは、シンプルで効率的とフィコシアニン、アロフィコシアニンこのモデル シアノ バクテリアでの定量のための信頼性の高い方法をについて説明します。フィコビリタンパク質抽出吸光光度定量のいくつかの方法を比較しました。このプロトコルに従って抽出プロシージャもに応用したArthrospira sp.、 Cyanothece 、 Synechococcuselongatusの spスピルリナsp.など他のシアノ バクテリアの系統藍藻sp 紅藻チノリモに関して。様々 な分類から特定のフィコビリタンパク質の消散係数が異なることができ、それは、したがって、すべての単一のひずみの吸光光度定量法を個別に検証にオススメします。プロトコルは、少し時間が必要です、のみ標準装備が必要なので、任意の標準的な生命科学の研究所で実行できます。
Introduction
fPhycobiliproteins は原核生物のシアノ バクテリア (ラン藻) 光捕集アンテナといくつかの真核生物分類群 (Glaucophyta、紅藻の主要コンポーネントを表す水溶性色素蛋白複合体、およびCryptophyta)1。超分子複合体フィコビリソームを呼ばれてとして主に発生して、彼らは通常間質側Cryptophytaで、フィコビリタンパク質をローカライズする場所を除いて光合成膜の表面に接続されて、チラコイド ルーメン2。日までフィコビリタンパク質の 4 つのタイプが識別されている: コア アロフィコシアニンと末梢フィコシアニン、フィコエ リスリンと phycoerythrocyanin1。主要集光性複合体としてフィコビリソームは藻類やシアノ バクテリアの大量文化生産性の重要な要因の 1 つを表します。フィコビリソーム切り捨ては強い光3の下でバイオマス蓄積を高めることができることが実証されています。一方、中程度あるいは低照度下でアンテナ切り捨ては成長率とバイオマス蓄積低減3,4で起因しました。フィコビリタンパク質、食品添加物、化粧品業界、医薬品、食品の着色剤と蛍光として商業栽培されているプローブをフローサイトメトリー、蛍光イムノアッセイ蛍光顕微鏡5のアプリケーション。
このプロトコルは、モデル シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の定量分析に焦点を当てください。シアノ バクテリアが、最も早く酸素光合成独立栄養;彼らは 24 億年6以上の地球の生物圏を形成しました。彼らは、窒素、炭素、酸素、およびその他の要素のグローバル物質循環に重要な役割を果たします。シアノ バクテリアの間で単細胞ひずみ阻害全体のゲノムを持つ最初のシアノ バクテリアだったのでユニークなポジションを得たシーケンス7、8、外因性 DNA9、当然のことながら変形、安定的かつ比較的高速な成長10,11を実行します。阻害アンテナのコアコンポーネントにアロフィコシアニン、不可欠な膜タンパク質に関連付けられてし、添付のフィコシアニンはチラコイド膜周辺に位置します。
フィコビリタンパク質抽出と定量化のためのいくつかのメソッドは、このプロトコルで比較されます。Cyanothece sp Synechococcuselongatus、スピルリナsp.、 Arthrospiraを含む他のシアノ バクテリアの系統だけでなく阻害、最終的な抽出プロシージャが正常に適用されましたsp.と藍藻の sp は、紅藻チノリモにも正常に適用されました。したがって、このプロトコルで提案する手法は、フィコビリタンパク質抽出のための普遍的な方法として考えることが。ここに抽出手順が説明されている最高のフィコビリタンパク質利回りクロロフィルの残渣の最も低いコンテンツと共に提供されるにもかかわらず、いくつかのテストの抽出方法は、総蛋白収量の結果、フィコビリタンパク質を抽出します。クロロフィルの内容を減らすことは、正しいフィコシアニン、アロフィコシアニン吸光光度定量のために不可欠だった。
フィコビリタンパク質吸収スペクトルが様々 な藻類やシアノ バクテリア種12,13,14,15,16,17の間で大きく異なるし、も単一のシアノ バクテリア属18系統。したがって、特定の波長と吸収係数としてフィコシアニン、アロフィコシアニン阻害での定量は一般的に他の系統に適用されません。また、フィコエ リスリンと他の藻類とシアノ バクテリアで見つけることができる phycoerythrocyanin、阻害は含まれません。阻害以外の系統のフィコビリタンパク質の定量を目的として、各緊張に吸光光度式を個別に評価することをお勧めします。
プロトコルには (細胞ペレットおよび 1 時間蛋白質の抽出の一晩凍結乾燥) 長いの 2 つの手順が含まれています、フィコビリタンパク質定量化のための総労働時間は 2 時間以内。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、単純な高速で、再現性のあるモデル シアノ バクテリア阻害フィコビリタンパク質含量の定量法について説明します。セルの均質化、蛋白質の抽出、フィコシアニン、アロフィコシアニン定量化のいくつかの方法が比較され、最終的なプロトコルは、すべて単一の最適な手順の組み合わせを表します。代表的なデータとして光強度の増加の下で阻害細胞の?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロトコルは、以前出版11から採用されました。T. Z.、d. ch. と j. Č. 教育省、青年および国家の持続可能性プログラムの中でチェコ共和国のスポーツによって支えられた私 (当社私)、許可番号 LO1415。J. Č。 また GA CR、許可番号 18-24397S によって支えられました。楽器やその他の施設へのアクセスは、システム生物学 (プロジェクトなし LM2015055) C4SYS チェコ研究基盤によって支えられました。M. A. s. はロシアの科学財団 [第 14-14-00904] からの助成金によって支えられました。
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
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