Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização bioquímica de enzimas de RNA-modificando o fermento, Mod5 e discutir como este protocolo poderia ser aplicado a outras enzimas RNA-modificando.
Abstract
N6– isopentenyladenosine do RNA modificações é funcionalmente diversificada e altamente conservadas entre procariontes e eucariontes. Dentre as modificações de isopentenyladenosine –6N mais altamente conservadas ocorre na posição A37 em um subconjunto dos tRNAs. Esta modificação melhora a eficiência de conversão e fidelidade, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma. Mutação das enzimas responsáveis por essa modificação em eucariontes estão associados a vários Estados de doenças, incluindo câncer e disfunção mitocondrial. Portanto, compreender a especificidade de substrato e actividades bioquímicas destas enzimas é importante para a compreensão da biologia eucariótica normal e patológica. Um diversificado leque de métodos tem sido empregado para caracterizar eu6A modificações. Aqui é descrita uma abordagem direta para a detecção de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza a incubação de RNAs com uma transferase de isopentenilo recombinantes, seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional eu detectar6A modificações. Além disso, a potencial capacidade de adaptação do presente protocolo para caracterizar outras enzimas RNA-modificando é discutida.
Introduction
Foram identificadas pelo menos 163 modificações de RNA posttranscriptional distintas, com estas modificações conferem funções diversas e contexto-dependente de RNAs, directamente influenciam a estrutura do RNA e afetando interações de RNA com outros moléculas1,2. À medida que aumenta a apreciação para o número e variedade de modificações do RNA, é fundamental desenvolver ensaios que podem confiantemente interrogar tanto as modificações de RNA e as enzimas que catalisam a eles.
Dentre as modificações de RNA primeiras a identificação ocorre em 37 base em tRNAs, adjacente a anticódon no 3′ lado3,4. Um grupo de isopentenilo é transferido de dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) para a posição N6 de adenosina 37 (eu6A37) 3,5 em um subconjunto dos tRNAs citoplasmática e mitocondrial. Eu6A37 melhora a fidelidade de tradução e eficiência, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma4,6 e eu6A37 é importante para a resposta ao estresse em bactérias7. As enzimas que realizam essa modificação são denominadas transferases de isopentenilo tRNA e são altamente conservadas em bactérias8,9, fungos10, vermes11, plantas12e uns eukaryotes13 , incluindo os seres humanos14.
Mutações do gene humano que o tRNA isopentenilo transferase, TRIT1, estão associadas a doenças humanas. Por exemplo, uma mutação no TRIT1 está correlacionada com uma grave doença mitocondrial, provavelmente causada por um defeito na síntese de proteína mitocondrial15,16. Além disso, TRIT1 tem sido descrito como um tumor supressor gene17,18 e está implicada em vários tipos de cânceres, incluindo o melanoma19, mama20, gástrico21e cânceres de pulmão22 ,23. Finalmente, TRIT1 e Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenilo transferases são propensas a agregação de proteínas que formam o prião-como fibras de amiloides24,25,26. Estas observações potencialmente implicam transferases de isopentenilo tRNA em doenças neurodegenerativas, embora a evidência direta para isso ainda não foi mostrada.
Tendo em conta o papel que isopentenilo transferases na tradução e na doença, métodos que diretamente eu medir6uma atividade de transferase de isopentenilo são importantes para uma compreensão mecanicista destas enzimas sob o normal e a Estados de doença. Um número crescente de métodos está disponível para detectar as modificações A RNA6, incluindo em vitro isopentenylation ensaios, hibridização positiva na ausência de i6ensaios de um (PHA6), fino cromatografia em camada delgada (TLC), aminoácido ensaios de atividade de aceitação e abordagens de espectrometria de massa (revisado em ref. 4).
Um ensaio de isopentenylation em vitro tem sido descrito que utiliza 14C-DMAPP e tRNAs sem rótulo. Neste ensaio, carbono radioactivo é transferido para RNA de 14C-DMAPP pelo transferase de isopentenilo. Enquanto este ensaio é altamente sensível, muitas vezes é difícil determinar o resíduo específico que é modificado9,20,27. PHA6 ensaios dependem o volumoso eu6A modificação interferindo com hibridação de uma sonda P-etiquetada 32, abrangendo os resíduos modificados. Como tal, a hibridação é maior na ausência de um i6uma modificação18,28,29. Ensaios de PHA6 são altamente sensíveis e capazes de analisar o RNA total extraído de lisado celular. Além disso, a capacidade de projetar sondas específicas para o RNA de interesse dá essa flexibilidade de alvo substancial do método. No entanto, PHA6 ensaios são limitados para a caracterização das modificações que ocorrem na resíduos dentro da região de destino da sonda e, portanto, são menos propensos a identificar sites novel modificação. Além disso, como ausência de vinculação é indicativa de modificação, outras modificações ou mutações que afetam a ligação de RNA vão confundir a análise dos dados.
Outra abordagem combina cromatografia de celulose benzílico DEAE celulose (BD) com atividade de aceitação de aminoácidos como uma leitura de i6A modificações no tRNA30. Esta abordagem ensaios diretamente a função do i6A modificação, mas isso é uma abordagem indireta para eu detectar6A modificação e carece de resolução para mapear as modificações de um resíduo específico no ARN. Uma abordagem de TLC tem sido usada para detectar tRNA total eu6A modificações. Nesta abordagem, internamente 32P-rotulado os tRNAs são digeridos de nucleotídeos simples e análise bidimensional do TLC é usado para identificar o isopentenylation. Esta abordagem é altamente sensível na detecção de eu total6A uma determinada amostra de RNA, mas após a digestão, todas as informações de sequência serão perdidas; assim, o investigador não tem meios de determinar quais resíduos foram modificados31.
Mais recentemente, líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) foram desenvolvidos métodos que comparar quantitativamente modificações de RNA totais entre espécies, tipos de células e condições experimentais32,33, 34. Uma limitação desta metodologia é que é menos capaz de determinar a identidade e a posição dentro do RNA do qual os nucleosídeos modificados foi derivada34. Além disso, os conhecimentos e equipamentos necessários à execução dessas experiências limitam a praticabilidade desta abordagem.
Além disso, desenvolveram-se várias tecnologias de sequenciamento de nova geração para mapear RNA modificações transcriptome nível34. Imunoprecipitação de RNAs com anticorpos específicos para uma determinada modificação (RIP-Seq) permitem que o investigador identificar todas as sequências contendo uma modificação específica35,36. Além disso, abordagens de transcriptase reversa como Chem-Seq e sequenciamento de incompatibilidade não-aleatória dependem de perturbações da reação de transcrição reversa nos resíduos modificados37,38,39. Apesar da vantagem destas técnicas para mapear todo o transcriptoma RNA modificações, RIP-seq e Chem-Seq tecnologias são limitadas pela falta de confiança anticorpos ou Reactivos químicos disponíveis para cada alteração específica, respectivamente,34. Além disso, as enzimas transcriptase reversa necessária para executar Chem-Seq e técnicas de sequenciamento de incompatibilidade não-aleatório podem ser impedidas por estruturas estáveis de RNA. A natureza altamente modificada e estruturalmente estável de tRNAs torná-los especialmente difícil para interrogar usando essas técnicas. Até à data, tecnologias de próxima geração baseadas em sequenciamento ainda não foram utilizadas para mapear eu6modificações34.
Aqui, descrevemos uma abordagem simples e direta para detectar6A tRNA modificações em vitro. Este método utiliza a incubação de RNAs com recombinante S. cerevisiae isopentenilo transferase (Mod5), seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional Mapear6A modificações. Esta abordagem é direta e requer pouco especializado para analisar os dados. Além disso, este método é adaptável a outro RNA modificando enzimas, incluindo enzimas que covalentemente mudam o peso molecular de RNA ou mobilidade de um RNA através de um gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações de RNA continuam a ser mostrado para desempenhar um papel cada vez mais importante e diverso no celular e a função. Como tal, o desenvolvimento de ensaios para interrogar o RNA enzimas de modificação é fundamental para compreender melhor os aspectos fundamentais da biologia. Este protocolo descreve um ensaio de alta resolução em vitro para caracterizar a atividade de modificação do tRNA do Mod5.
Este protocolo tem a vantagem de fornecer uma leitura direta e fac…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o Dr. David Engelke por sua orientação e comentários úteis sobre este manuscrito. PJS – fundos de inicialização de laboratório Ball State University; DAB – conceder 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
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