Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde
Summary
Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.
Abstract
Hangi yakalayabilir ve mikroplar yok nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), aktif. Son yıllarda yapılan çalışmalarda NETs, otoimmün hastalığı, kan pıhtılaşması ve tümör Metastazlari gibi çeşitli hastalık süreçlerini katılmaktadırlar öneririz. İşte, bindirme ağları için ek sonra büyümek ücretsiz tümör hücrelerinin sırasında NET faaliyet algılamak için detaylı vitro tekniği göstermektedir. İlk olarak, biz düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) laparotomies yapılan hastaların postoperatif peritoneal lavaj sıvı toplanan. Kısa vadeli LDN kültür yeşil floresan nükleer ve kromozom counterstain ile görüntülenmiştir büyük NET oluşumu sonuçlandı. Sonra eş kuluçka insan mide kanseri hücre hatların MKN45, OCUM-1 NUGC-4 ağları ile birçok tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın. Daha sonra ek tamamen DNaz ı. Time-lapse video ağları tarafından tuzağa tümör hücreleri ölmek ortaya ağlar bozulması tarafından kaldırıldı ama bunun yerine şiddetle sürekli bir kültürde büyüdüm. Bu yöntemler ağlar ve hücreleri ve materyaller çeşitli yapışkanlı Hofstede tespiti için uygulanabilir.
Introduction
Polimorf nükleer nötrofiller kan dolaşan içinde genelde yoğunluk gradient hazırlama yöntemi mononükleer hücreler ayrılır. Ancak, bazı nötrofil düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), CD11b(+), CD15(+), CD16(+) ve CD14(-) fenotipleri ile bilinen mononükleer hücreler ile birlikte saf. LDN göreli sayısı otoimmün hastalıklar1,2, sepsis3ve kanser4,5de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarında önemli ölçüde artırır. Önceki çalışmalarda LDN nötrofil6phenotypically ve işlevsel olarak ayrı bir sınıf olduğunu göstermiştir. Bu unutulmamalıdır ki kan dolaşan içinde LDN nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) normal yoğunluk nötrofil2,7‘ den üretmek olasılığı vardır. Ağlar nükleik asitler, histon, proteaz ve taneli ve sitozolik protein oluşan web benzeri yapılar, ve verimli bir şekilde tuzağa ve patojenler8yok.
Son zamanlarda, NETs sadece mikroplar, ama aynı zamanda trombosit ve dolaşan trombus olgusu oluşumu9 ve tümör Metastazlari10,11‘ yardımcı olabilir tümör hücreleri yakalamak için gösterilmiştir. Ancak, ağlar ve trombosit veya tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler arkasında moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, bir vitro yapışma tahlil myeloid lösemi hücreleri (K56212) ve Akciğer Karsinomu Hücre (A54913) ağlar için β1 ve β3 integrinler yolu ile atamanız da ortaya koydu. Yazarlar nötrofil izole ve phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olarak yapışma substrat14tarafından aktive NET stok kullanılır. Bu tahlil NET bileşenleri ile gerçek etkileşim tespiti nötrofil yokluğunda sağlar, “hücre-ücretsiz NET hisse senedi” ile yüksek hızlı Santrifüjü izole moleküler yapısı içinde üretilen Nets aynı olup olmadığı korur tartışılabilir olsa da Vivo. Son zamanlarda, sonra karın ameliyatı büyük ağlar oluşturulan ve periton Metastazlari15neden tümör hücrelere bağlı olan birçok olgun LDN bulunan peritoneal lavaj sıvıyı bulduk. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde herhangi bir fiziksel manipülasyon olmadan sağlam Nets tümör hücrelerinin yapışma inceledi. İşte, ağlar ve ücretsiz tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler algılamak için bir teknik ayrıntılarını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalarda tümör hücreleri dolaşan NET yüzeylerde vivo içinde10,11tarafından kapana olduğunu bildirdi. Metastatik meme kanseri hücrelerinin nötrofil uyarmak ve hangi tümör hücre büyümesini hedef organ17yardımcı olur ağlar, oluşumu teşvik gösterilmiştir. Buna ek olarak, biz kısa vadeli kültürleri LDN ameliyat sonrası lavaj sıvı üzerinden verimli bir şekilde tümör hücreleri daha fazla st…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan J. Shinohara ve ı. Nieda teknik ve idari personel çalışma için teşekkür ederiz. Ayrıca, biz Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina ve Kazuya Takahashi ameliyathane örnek edinme için işbirliği için teşekkür ederiz. Bu eser bir Grant-in-Aid tarafından Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya ve Japonya Derneği bilimsel araştırma bilim promosyon (17 K 10606) için destek verdi.
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
Referencias
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Investigación sobre el cáncer. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Investigación sobre el cáncer. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
