זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה
Summary
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.
Abstract
התערבות RNA – ו גנום עריכה המבוססת על הקרנת פלטפורמות היה בשימוש נרחב כדי לזהות גורמים התא המארח להגביל את וירוס שכפול. עם זאת, את המסכים הבאים נערכות בדרך כלל בתאים באופן טבעי מתירניות לגורם המחלה ויראלי שנבחנה. לכן, השכפול חזקים של וירוסים בתנאי בקרה עלולה להגביל את הטווח הדינמי של המסכים הבאים. יתר על כן, המסכים הבאים עשויים להיות מסוגל לזהות בקלות מסלולים ההגנה התאית שמגבילות את שכפול הוירוס אם הווירוס הוא סטוש למחשב המארח ובעל יכולת של המאבק הגנות אנטי-ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים פרדיגמה חדשה עבור חקר וירוס-פונדקאי אינטראקציות באמצעות מסכי מרכז על זיהומים שנכשל באופן טבעי על ידי arboviruses כגון vesicular stomatitis וירוס (VSV). למרות יכולת VSV לשכפל במגוון רחב של חרקים dipteran ומארח יונקים, VSV עובר זיהום, הכניסה לאחר שנכשל במגוון של שורות תאים שמקורם חרקים lepidopteran, כגון העש צועני (Lymantria dispar). עם זאת, זיהומים VSV שנכשל אלה יכולים להיות “לחלץ” כאשר המארח תא הגנות אנטי ויראליים הם בסכנה. נתאר כמה זנים VSV קידוד גנים כתב נוח ולא מגבילים ל’ dispar שורות תאים ניתן לזווג מסכי הגדרת לזהות מארח גורמים מעורבים arbovirus ההגבלה. יתר על כן, אנו גם מראים את התועלת של כלים אלה ההקרנה הזיהוי של גורמים לשווק מקודד להציל VSV שכפול במהלך coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי, כולל אלה מקודד על ידי וירוסים יונקים. ההגבלה הטבעי של שכפול VSV בתאים dispar ל’ מספק יחס אות לרעש גבוה בעת הקרנת עבור התנאים המקדמים הצלה VSV, ובכך מאפשר שימוש פשטני הפריה חוץ גופית – קרינה פלואורסצנטית מבוססי מבחני לפקח השינויים VSV שכפול. מתודולוגיות אלו הם בעלי ערך להבנת יחסי הגומלין בין המארח תגובות אנטי ויראלי התחמקות המערכת החיסונית גורמים.
Introduction
היכולת של וירוס לשכפל באופן פרודוקטיבי שורה מסוימת כפוף באופן חלקי הזמינות של התא המארח גורמים התומכים נגיפי כניסה של שכפול1. הטווח וירוס-המארח יכול גם יכתיב את הקיבולת של וירוס מונה הגנות אנטי ויראליים הסלולר הפוגעים אחרת שכפול ויראלי2,3. זה התוצאה של אינטראקציות אלה מורכבים וירוס-מארח זה בסופו של דבר להחליט אם וירוס יהיה מסוגל להשלים את מחזור חייו מארח מסוים. לאור ההשלכות החולני שעשויות להיות עבור המארח אם שכפול ויראלי מתפתח, זה קריטי לפתח אסטרטגיות ניסיוני כדי לקדם את ההבנה שלנו של אינטראקציות וירוס מפתח-מארח זה יכול להטות את הכף בין שנכשל ופורה זיהומים. שחקרתי את התכונות מולקולרית של וירוס-פונדקאי הגומלין יהיה אינסטרומנטלי הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות אנטי ויראליים חדשה ואלטרנטיבית.
עם כניסתו של RNA הפרעה (RNAi)4,5 , כלים לעריכת הגנום (למשל., CRISPR-Cas9, אבץ אצבע nucleases, TALENs)6,7, זה הפך ריאלי השפעול לשנות הביטוי של גורמים הסלולר על הגנום כולו מאזני ולחקור את ההשפעה של שינויים אלה על שכפול הוירוס. ואכן, רבים RNAi, מסכי הגנום-עריכת מבוססי נערכו סוגי תאים הגעה והמארח חוליות זה יש חשפה היבטים חדשים של וירוס-פונדקאי אינטראקציות8,9,10, 11 , 12. המסכים הבאים בדרך כלל מעסיקים וירוסים קידוד כתבים, כמו גחלילית לוציפראז (לוק) או חלבונים פלורסנט (למשל., ה-GFP, DsRed), אשר מספקים אמצעי נוח באופן כמותי להערכת ביטוי גנים ויראליים כמו הבדיקה שכפול ויראלי9,12. אסטרטגיה זו מאפשרת לחוקרים לזהות גורמים מארח או לקדם או להרגיז שכפול ויראלי, כפי שמעידים עליות או ירידות, בהתאמה, ב כתב ויראלי אותות9,12. עם זאת, ברוב המכריע של המקרים, את המסכים הבאים נערכו באמצעות וירוסים מותאמים היטב סוג התא המארח שבו הם נמצאים נחקר. אסטרטגיה זו יכול להיות חשוב להבנת היחסים coevolutionary בין פתוגנים ויראליים מארחיהם טבעי, זה להוות יסוד חששות לגבי השימוש בהם במסגרת חשיפת מארח גורמים אנטי-ויראלי. במקרים אלה, שיפור בוירוס כתב אות RNAi נוקאאוט הוא להיות חיפש, או איון של הסלולר גורם בדרך כלל פוגעת שכפול ויראלי. ראשית, אם וירוס כבר אפשרות לשכפל robustly בתא המארח נבדק בתנאים שליטה, הטווח הדינמי של המסך (כלומר, את היכולת להבחין בין הרקע לבין אותות משופרת כתב ויראלי) עלולה להיות מוגבלת. שנית, בעיה זו מורכב עוד יותר על ידי המצבים בהם הנגיף הוא סטוש לתא המארח ויעיל -המאבק מארח ההגנה מסלולים המיועדים במסך.
בשל החשש לעיל לגבי האינטראקציה וירוס המסורתי-מארח הקרנות שיטות, פיתחנו פרדיגמה חדשה ללמוד אינטראקציות וירוס-פונדקאי לנצל arbovirus שנכשל באופן טבעי זיהומים בתאי חרקים lepidopteran. אסטרטגיה זו נובעת התבוננות arbovirus למד היטב האדם, VSV, עובר זיהום שנכשל בתאים שמקורם עש הצועני (ל’ dispar)13. VSV מועברת באופן טבעי על ידי חרקים dipteran (קרי, זבובי חול) בתרבית של המארחים, הוכח בניסוי כדי להדביק את מגוון רחב של חסרי חוליות, מארחים חוליות ב תא תרבות, אין ויוו14. הגנום RNA חד-גדילי של שלילי-סנס 11-kb של VSV מקודד mRNAs subgenomic חמש אחד המתורגמים לתוך החלבונים המרכיבים את מעטפת virion. עם זאת, מערכות גנטיות הפוכה VSV אפשרו ליצירת זנים שכפול-המוסמכת קידוד לוק או חלבונים פלורסנט, בנוסף חמש טבעי VSV ג’ין מוצרים15,16,17. כי לא משולבים חלבונים אלה כתב virion VSV, הם מספקים readout נוח של ביטוי גנים VSV המתרחשת הפוסט פוסט. באמצעות זנים VSV קידוד GFP או לוק, אנחנו בעבר הראו כי ביטוי גנים VSV היא הוגבלה בצורה קשה על כניסתם של תאים LD652, כי VSV titers לא להגדיל על ידי 72 שעות לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של). לעומת זאת, coinfection של תאים LD652 עם VSV, את בתרבית של poxvirus, וירוס vaccinia (VACV), מוביל לוגריתמי מגביר התבטאות גנים VSV והן titers ובשלב זה הזמן. VACV עובר מוקדם ביטוי גנים, שכפול ה-DNA, ביטוי גנים מאוחר LD652 תא זיהומים, אבל בסופו של דבר שנכשל בשל virion לא שלם מורפוגנזה18מחזור שכפול VACV. הגנום גדולות של DNA ~ 192 kb של VACV מקודד > 200 חלבונים, שרבים מהם להציג מאפייני immunomodulatory לקדם שכפול ויראלי דרך הדיכוי של תגובות חיסוניות מארח19. לכן, שיערנו כי “חילוץ” שכפול VSV בתאים LD652 על ידי VACV coinfection היה ככל הנראה מתווכת על-ידי immunomodulators VACV זה עכבות תגובות ל’ dispar בדרך כלל הגבלת VSV שכפול. כדי לתמוך בזה, הטיפול של תאים LD652 עם מארח ה-RNA פולימראז II המדכא ואקטינומיצין D גם מציל שכפול VSV בתאים LD652, המציין כי התגובות תלויי-תמלול מארח לחסום VSV שכפול פוסט-הפוסט13.
התצפיות הנ ל מציע כי הטבע מגבילות באופן טבעי של תאי LD652 לזיהום VSV עשוי לספק רקע נמוך יחסית בעת הקרנת עבור התנאים המשפרים את הכתב מקודד VSV אותות (כלומר, כאלה לעכב את המארח הגנות אנטי-ויראלי). כאן, אנו מספקים שיטות באמצעות קרינה פלואורסצנטית או מבוסס-לוק מבחני המסך עבור תנאי זה להקל על הגבלת VSV בתאים lepidopteran. ראשית, אנו מראים כמה מבחני אלה ניתן להשתמש כדי לזהות גורמים לשווק מקודד immunomodulatory לשבור את ההגבלה VSV במהלך ניסויים או coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי של גורמים נגיפיים המועמד. כדוגמה, אנחנו מדגימים איך היינו אלה טכניקות ההקרנה כדי לזהות חלבונים A51R מקודד poxvirus כמשפחה חדשה של גורמים immunomodulatory להציל את שכפול VSV בהיעדרו של גורמים אחרים poxvirus13. שנית, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש RNAi הקרנת מגבילות VSV-LD652 תא זיהומים ישירות לזהות מארח האיקריוטים הגורמים המעורבים הגבלת arbovirus13.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תארנו מבחני פשוטה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות על המסך עבור תנאי זה להציל את שכפול VSV בתרבויות תא lepidopteran מגבילים. זיהום שנכשל של VSV בתאים lepidopteran יוצר יחס אות לרעש מעולה כאשר assaying על ביטוי גנים VSV. למשל, האותות LU זוהה lysates מדלקות VSV-לוק יחיד היו ~ 1,000-fold גבוה בהרבה lysates נגועה מעושה, אך א…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ה2 נתמכה על ידי מימון מתוכנית חוקרים מאוניברסיטת טקסס הדרומית-מערבית למרכז הרפואי של מחונן. המחברים תודה מייקל Whitt (המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טנסי) שון ווילן (הספר לרפואה של הרווארד) למתן VSV-DsRed ו- VSV-לוק. המחברים מודים גם גארי Luker (בית הספר לרפואה באוניברסיטת מישיגן) על מתנה נחמדה של המתח VACV-FL-GFP.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
Referencias
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
