Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Summary

Qui, presentiamo un metodo per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila , sostituendo il primo esone codifica dei geni con driver di trascrizione. Il metodo basato su CRISPR/Cas9 inserisce una sequenza di transactivator ai sensi del regolamento endogeno di un gene sostituito e di conseguenza facilita transctivator espressione esclusivamente in reticoli spatiotemporal gene-specifico.

Abstract

Sistemi di trascrizione binario sono potenti strumenti genetici ampiamente usati per la visualizzazione e manipolazione cellulare destino e l’espressione genica in specifici gruppi di cellule o tessuti in organismi modello. Questi sistemi contengono due componenti distinte linee transgeniche. Un’autista linea esprime un attivatore trascrizionale sotto il controllo di promotori tessuto-specifici/Enhancer, un reporter/effettrici linea porticcioli e un gene bersaglio posizionato a valle per il sito di legame dell’attivatore di trascrizione. Animali che harboring entrambi i componenti inducono la transattivazione di tessuto-specifica di un’espressione di gene di destinazione. Spazio-temporale precisa espressione del gene in tessuti mirati è critica per interpretazione imparziale dell’attività del gene e delle cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un metodo per la generazione di linee di esclusivo cellula/tessuto-specifico driver è essenziale. Qui presentiamo un metodo per generare il sistema di espressione mirati altamente tessuto-specifica con l’ausilio di un “cluster regolarmente Interspaced breve palindromi Repeat/CRISPR-associated” (CRISPR/Cas)-base tecnica di editing genomico. In questo metodo, l’endonucleasi Cas9 è bersagliato da due chimerico guida RNAs (gRNA) a siti specifici nel primo esone codifica di un gene nel genoma della drosofila per creare rotture a doppio filamento (DSB). Successivamente, utilizzando un plasmide di donatore esogeno contenente la sequenza di transactivator, il macchinario di riparazione delle cellule-autonoma consente il ripristino diretto di omologia (HDR) del DSB, con conseguente eliminazione precisa e sostituzione dell’essone con il transactivator sequenza. Il transactivator bussò-in è espresso esclusivamente in cellule dove il cis-elementi regolatori del gene sostituito sono funzionali. Il protocollo dettagliato passo-passo qui presentato per la generazione di un driver binario trascrizionale espresso in Drosophila fgf/prive-producendo le cellule epiteliali/neuronali può essere adottato per qualsiasi espressione di gene – o tessuto-specifico.

Introduction

Casella degli strumenti genetico per espressione genica mirata è stato ben sviluppato in Drosophila, che lo rende uno dei migliori sistemi di modello per studiare la funzione dei geni coinvolti in un’ampia varietà di processi cellulari. Sistemi di espressione binaria, come il lievito Gal4/UAS (sequenza di attivazione a Monte), fu adottato per risultati di intrappolamento e gene tessuto-specifici enhancer in Drosophila modello genetico¹ (Figura 1). Questo sistema ha facilitato lo sviluppo di un gran numero di tecniche come la regolazione spazio-temporale della sovraespressione genica, risultati, Ko in gruppi selezionati di cellule pure come ablazione delle cellule, cellule marcatura, tracciatura dal vivo di cellulari e molecolari processi in embrione e tessuti, lignaggio traccia e analisi di mosaico durante lo sviluppo. Un numero del sistema binario trascrizione, ad esempio il batterica LexA/LexA_op system (Figura 1) e Neurospora Q-system, sono potenti strumenti genetici che ora sono ampiamente usati in Drosophila, oltre a l’originale sistema Gal4/UAS per gene bersaglio espressione^1,2,3.

Qui, presentiamo un metodo per generare il sistema altamente affidabile tessuto-specifica espressione binaria impiegando una tecnica di modifica del genoma. I recenti progressi nella tecnologia di editing CRISPR/Cas9 genoma hanno permesso opportunità senza precedenti per apportare modifiche di genoma diretto in una vasta gamma di organismi. Rispetto ad altre tecniche di editing disponibili genoma, il sistema CRISPR/Cas9 è economico, efficiente e affidabile. Questa tecnologia utilizza componenti del sistema immunitario adattativo batterico: un’endonucleasi di Cas9 di Streptococcus pyogenes che crea una rotture a doppio filamento (DSB) e un RNA chimerico guida (gRNA), che guida il Cas9 a un sito particolare genoma per mirati DSB⁴. Le cellule contengono i macchinari per riparare il DSB utilizzando percorsi diversi. Non-omologa fine unirsi (NHEJ) conduce a piccoli inserimenti o eliminazioni di perturbare la funzione del gene, mentre riparazione omologia-diretto (HDR) introduce un definito diretto/desiderabile genomico knock-in/knock-out utilizzando un donatore HDR esogeno come modello. La strategia di sostituzione basato su HDR possa essere utilizzata in modo efficiente per generare un sistema altamente affidabile espressione binaria di tessuto-specifici, in grado di superare tutte le limitazioni dei metodi tradizionali enhancer trap. Descriviamo una procedura dettagliata per l’utilizzo di riparazione basato su CRISPR/Cas9 HDR nella generazione di una linea di driver binario trascrizione che si esprime sotto il controllo del regolamento endogeno trascrizionale e di un di Drosophila gene. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di una linea di driver specifica per prive (bnl) gene codifica per una proteina di famiglia di FGF che regola la morfogenesi di ramificazione della via aerea tracheale epitelio⁵. In questo esempio, il primo esone codifica del gene di bnl è stato sostituito dalla sequenza di una sequenza di transactivator LexA batterica senza alterare qualsiasi endogeno cis-sequenze regolarici del gene di bnl . Mostriamo che la strategia generato una linea di driver di bnl-LexA che spatiotemporally controlla l’espressione di un gene del reporter posizionato a valle di LexAoperator (LexAop o LexO) esclusivamente in bnl- che esprimono le cellule epiteliali/mesenchymal/neuronali.

Protocol

1. progettare e costruire il gRNA vettore di espressione Per appunto sostituire una regione lungo definita di un esone, utilizzare una gRNA doppio approccio6, in cui ogni gRNA puoi indirizzare specificamente due estremità dell’area di interesse selezionata. Per ottenere un’accurata espressione spatiotemporal gene-specifico del driver, selezionare due siti di destinazione gRNA entro il primo esone codifica del gene. Per Drosophila melanogaster, selezionare i s…

Representative Results

Questo protocollo è stato usato con successo per generare un sistema specifico di espressione binaria mirati reporter per bnl che esprimono le cellule5. Il cis-elementi regolatori (CREs) che controllano l’espressione complessa spatiotemporal bnl non sono caratterizzati. Pertanto, per raggiungere spatiotemporal espressione sotto il controllo della sequenza regolamentazione endogeno bnl , solo il primo esone codifica di bnl</e…

Discussion

Tradizionalmente, trappole del rinforzatore di Drosophila sono stati generati da due diversi metodi. Uno dei modi include l’inserimento casuale di un driver (es., Gal4) sequenza del genoma di recepimento (ad es., trasposizione elemento P)¹ . In alternativa, le sequenze di driver possono essere posizionate sotto il controllo trascrizionale di una regione enhancer/promotore presunto in un costrutto di plasmide, che sarebbe poi integrato in una sede ectopica del genoma<sup …

Materials

X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	cloning
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	cloning
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Biología molecular
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Biología molecular
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Biología molecular
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Biología molecular
10%SDS	Sigma Aldrich	71736	Biología molecular
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Biología molecular
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Biología molecular
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriction enzyme
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA template for LexA amplification
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Biología molecular
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Biología molecular
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Biología molecular
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Biología molecular
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Biología molecular
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Biología molecular
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Fly line
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA quantification