Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação
Summary
Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.
Abstract
Potencialização dos hostis antibodies monoclonal (mAb) por agentes quimioterápicos constitui uma estratégia valiosa para a concepção de terapia eficaz e segura contra o câncer. Aqui nós fornecemos um protocolo para identificar uma combinação racional na etapa pré-clínica. Primeiro, nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar o sinergismo entre mAb anticâncer e drogas citotóxicas, que utiliza a equação de índice de combinação de Chou e Talalay1. Isso inclui a medição de tumor celular droga-anticorpo-sensibilidade e usando um ensaio de MTT, seguido por uma análise automatizada de computador para calcular os valores de índice (CI) de combinação. Valores de CI de < 1 indicar sinergismo entre mAbs testado e agentes citotóxicos1. Para corroborar o em vitro achados na vivo, descrevemos mais um método para avaliar a eficácia do regime de combinação em um modelo de tumor de enxerto. Neste modelo, o regime combinado significativamente atrasa o crescimento do tumor, o que resulta em uma significativa sobrevivência prolongada em comparação com controles de único agente. Importante, a experimentação na vivo revela que o regime de combinação é bem tolerado. Este protocolo permite a avaliação eficaz das combinações de drogas anticâncer em modelos pré-clínicos e a identificação de uma combinação racional de avaliar em ensaios clínicos.
Introduction
A abordagem convencional no tratamento de um grande número de diferentes tipos de câncer foi baseada em monoterapia. Mesmo que ainda é usado em muitos casos, este método encontrou vários obstáculos levando a optar por terapias combinadas2. Particularmente, as células cancerosas são mais suscetíveis a desenvolver resistência quando tratados com uma única droga através da indução de sobrevivência alternativa mecanismos3, resultando em falha terapêutica em pacientes4. Além disso, em monoterapia, drogas são administradas geralmente em uma dose alta. Essa situação geralmente resulta da ocorrência de fortes efeitos colaterais de dose-dependente que pode ser intolerável e forçar os médicos a parar o tratamento2. Por estas razões, a associação de moléculas anticâncer é agora preferiu em monoterapia.
Combinações de drogas ideal seriam aqueles que agem em sinergia contra células tumorais, sem maior toxicidade contra células normais. Sinergismo refere-se a interação de duas ou mais drogas que produz um efeito terapêutico maior que a soma de cada fármaco individual agindo separadamente. Tais interações podem resultar em maior eficácia terapêutica clínica2. Isso limita a resistência de tratamento aumenta a eficácia e também pode reduzir a toxicidade2. Na verdade, a dose de cada fármaco pode ser reduzida para diminuir seus efeitos colaterais, orientando caminhos diferentes. Além disso, uma das moléculas também pode servir como um agente de sensibilização contra células cancerosas. O efeito da segunda droga pode ser melhorado em células sensibilizadas e menos dosagens podem ser usado5.
Terapia combinada pode incluir dois ou mais quimioterápicos e/ou produtos biológicos, tais como anticorpos monoclonais6. Esses mAbs voltados especificamente para as células expressando um antígeno de superfície celular de interesse e são capazes de matar células tumorais através de vias imunológicas, incluindo a citotoxicidade mediada por células do anticorpo-dependente (ADCC), com a participação de células imunes efetoras 7e citotoxicidade complemento-dependente (CDC)6. Eles também podem atuar através de um mecanismo não-imunológica mediado por apoptose8,9,10,11. Neste caso, a indução do processo de morte celular programada pode sensibilizar as células cancerosas, enfraquecer sua função e que a droga associada quimioterápico mais eficazes em uma dosagem mais baixa. Como tal, proapoptotic mAb são bons candidatos para a concepção de regimes de combinação com fármacos antineoplásicos.
Diferentes modelos matemáticos têm sido descritos para avaliar sinergismo de drogas; um deles é baseado na combinação índice método1. Este método baseia-se no princípio da mediana-efeito desenvolvido por Chou1. A equação da mediana-efeito correlaciona a dose da droga e o efeito de drogas como segue.
Aqui, D é a dose de drogas; DM é a dose mediana-efeito; FA é a fração que afetaram a dose; m é um expoente que significa a forma do dose-efeito trama1. A dose de mediana-efeito é usada para calcular a dose Dx de uma droga que inibe ou mata “x” por cento das células. O valor de CI é então calculado para avaliar o efeito aditivo da combinação de drogas, da seguinte forma1.
CI o valor 1 indica um efeito aditivo e um valor de CI de 1 indica o antagonismo1. A aplicação deste método é facilitada pela disponibilidade de um programa de computador, CompuSyn, que determina o sinergismo e antagonismo em todas as doses ou níveis de efeito automaticamente simularam12.
O nosso grupo desenvolveu o mAb 8B6 específico para O-acetil-GD2 gangliosídeos (OAcGD2) neuroblastoma antígeno13 e ainda mais demonstrado que este mAb é capaz de induzir a morte celular com atributos de apoptosis11. Para testar se o mAb 8B6 pode sensibilizar as células de neuroblastoma de Topotecano o agente antineoplásicos, adaptamos o método acima mencionado, desenvolvido por Chou1. Primeiro, vemos a dose efetiva 50 (ED50) valores de mAb 8B6 e Topotecam. Em seguida, as células de neuroblastoma com equipotent rácios dos dois compostos com base nos valores de50 ED são expostas para determinar os valores de CI usando o software de simulação acima mencionados. Este método nos permite demonstrar sinergismo entre mAb 8B6 e Topotecano em vitro. Em seguida, descreveremos um protocolo para avaliar a potência e a segurança desta combinação regime na vivo. Este protocolo pode ser facilmente aplicado para selecionar mAb anticâncer potente e seguro e agente quimioterapêutico combinações em estudos pré-clínicos. Uma representação esquemática deste estudo é fornecida na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para prever o efeito de interações medicamentosas, podem ser usados três métodos: a metodologia de isobologram17, a mistura não-linear modelo18e a combinação do índice1. Análise do índice de combinação é o mais comumente usado porque sua aplicação é simplificada pela disponibilidade de um programa de computador user-friendly. Para esta finalidade, nós primeiro caracteriza a resposta de dose-efeito de cada agente usado sozinho ou em c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceder apoio: Fondation de Projet de L ‘Université de Nantes, les Bagouz’ à Manon, Ligue La contre le Cancer Comitê de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e Comitê de Vendée, une rosa pour S.A.R.A.H., L’Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les Cânceres et les leucémies de L’enfant et de L’adolescent (SFCE). M.B. e J.F. são suportados pela La Liga Contre Le Cancer. Os autores graças a UTE-facilidade da estrutura Fédérative de Recherche François Bonamy. Os autores também agradecer o Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) para fornecer as células IMR5 e a Sra. H. Estéphan para a assistência técnica.
Materials
| Cell Proliferation kit (MTT) | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn software | ComboSyn | Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com | |
| Electric shaver | Bioseb | BIO-1556 | |
| Fetal calf serum | Eurobio | CVFSVFF00-01 | 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ | |
| Heat lamp | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| Human neuroblastoma IMR-5 cell line | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | 2 mM in RPMI 1640 |
| Lysis solution | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | University of Nantes | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| Needle 21G 1 ½ | BD Microlance | 304432 | |
| Needle 25G 1 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG mice | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96-well microplates | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| PBS, 0,05% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| PC that runs windows 7 | Microsoft | Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640 |
| Reagent reservoir | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| Rodent restrainer | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| Syringe 1 mL | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| Topotecan | Sigma-Aldrich | T2705 |
Referencias
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